转录组学分析缺氧和高温应激下杂色鲍免疫防御机制

鲍是重要的海产贝类，但环境污染和全球暖化造成了鲍大规模暴发性死亡现象频发。因此阐明在缺氧和高温的环境胁迫下鲍的免疫防御机制，对于鲍的资源保护和人工养殖将具有重要的指导意义。本课题将在我们前期工作的基础上，收集杂色鲍分别和同时暴露于缺氧和高温后不同时相鳃、肝脏和血液的RNA，获得具标识码的线性化cDNA，以solexa高通量方法测定其序列，装配后进行EST功能注释；采用qRT-PCR芯片技术分析鲍分别和同时暴露于缺氧和高温的情况下，鲍免疫系统相关基因在应对环境胁迫的表达谱，对所获得的重要功能基因采用分子生物学方法进一步分析其结构和功能，应用Cytoscape等生物系统学分析软件，构建杂色鲍鳃、肝脏和血液在免疫应答过程中功能基因之间的作用网络和生物学通路，为在功能基因组水平研究鲍免疫应答机制及鲍免疫防御体系受环境胁迫抑制的分子机制奠定基础，为鲍免疫防治技术的建立提供科学依据。

本课题通过收集杂色鲍分别和同时暴露于缺氧和高温后不同时相鳃、肝胰腺和血液的RNA，以高通量测序获得血细胞的转录组。通过组装共获得99774条unigenes，通过Nr, Swiss prot，KOG，KEGG 数据库分析共有48191条获得注释，与240条KEGG途径相关。基因表达趋势分析显示杂色鲍在缺氧后再受到病原菌攻击机体的代谢和免疫等能力均显著受到了抑制。.基于上述转录组数据，共筛选出免疫相关基因200多条，涉及16条信号通路。利用这些基因我们设计了相对应的引物，制备了实时定量PCR芯片。采用该芯片分析了多条免疫信号通路相关基因在应对环境胁迫的表达谱，应用Cytoscape等构建杂色鲍在免疫应答过程中功能基因之间的作用网络和生物学通路。.对重要免疫应答功能基因的结构及通路进行了细致的研究。NF-κB信号通路：在缺氧、高温以及高温&缺氧联合暴露等不同的环境应激下，杂色鲍NF-κB信号通路20多个基因在不同的时相都有不同程度上的显著变化，表明NF-κB信号通路在鲍免疫防御过程中起重要的作用。HIF-1信号通路：杂色鲍的HdHIF-1α及其调控的多个基因在缺氧、高温、缺氧&高温联合应激以及副溶血弧菌感染后，均在不同时相发生不同程度的显著变化，表明HIF-1信号通路参与了鲍的免疫防御过程。热休克信号通路：杂色鲍HSP家族10多个基因在高温、缺氧以及高温缺氧联合应激下均发生了显著变化，不同时相出现的表达上调暗示了这些热休克相关基因参与了应激调控的整个过程。AKT-PI3K信号通路：杂色鲍AKT-PI3K信号通路4个基因在缺氧暴露后再受副溶血弧菌感染表达下调，说明该通路受到了不同程度的抑制。.进行了杂色鲍HSP90和HSC70的转录调控研究。获得了杂色鲍HSP90和HSC70的5’上游调控序列。HSP90的核心启动子区位于-98bp—+83bp之间。转录因子结合位点突变的分析说明Oct-1、C/EBPalpha、NF-1都对HSP90的转录起到一定的抑制作用。HSC70 基因的核心启动子区位于-104bp—+43bp之间。.这些研究结果为在功能基因组水平研究鲍免疫应答机制及鲍免疫防御体系受环境胁迫抑制的分子机制奠定了基础。