青蟹眼柄调控性腺发育分子机制的转录组学分析

性腺发育是受到许多不同基因和众多信号分子的复杂网络系统调控的。在国家自然科学基金的资助下，我们通过cDNA文库构建、EST分析、基因芯片构建和分析等方法获得了多个虾蟹性腺差异表达基因。在此基础上，本项目将利用新一代高通量测序方法大规模测定青蟹精巢和卵巢不同发育阶段的眼柄内分泌器官的转录组并进行分析和功能注释；所获得的独特转录子和本实验室现有青蟹的独特转录子合并，对有潜在意义的序列设计引物，制备高表征高通量实时定量PCR芯片。运用此芯片，可同时分析眼柄内分泌器官在精巢和卵巢不同发育阶段的基因表达谱及生殖腺在转录组水平对其的响应，在此基础上构建眼柄内分泌器官重要调控基因和性腺发育相关基因之间的基因作用网络。完成此项目将使我们对青蟹生殖系统发育的研究从调控系统（眼柄）至效应器官(生殖腺)均达到转录组水平。可为深入阐释青蟹内分泌器官活动规律及其调控性腺发育的分子机制，建立新的生殖调控技术奠定基础。

性腺发育是受到许多不同基因和众多信号分子的复杂网络系统调控的。类似于下丘脑神经垂体系统对脊椎动物生殖系统的调控作用，由X-器官窦腺复合体组成的虾蟹眼柄内分泌系统对虾蟹生殖系统的发育和分化起着至关重要的调控作用。在国家自然科学基金的资助下，我们利用新一代高通量测序方法大规模测定眼柄、性腺和肝胰腺的转录组并进行Unigene、GO、KEGG Pathway和差异基因等分析，获得了159025条的unigenes，其中共有8596条被注释。获得了很多参与生殖调控的信号通路：MAPK信号通路，细胞周期信号通路，黄体酮介导的卵母细胞成熟途径，促性腺激素释放激素信号通路，Wnt信号通路，p53信号通路，Hedgehog 信号通路，UPP途径，SUMO化通路，抗氧化系统通路等。从眼柄和性腺中筛选一批特异和差异表达的转录子制备实时定量PCR芯片研究在性腺发育的不同阶段重要信号通路的众多基因的表达谱。在此基础上，进行了CHH家族神经肽基因的研究，获得了在青蟹属首次报道的Sp-VIH基因的cDNA和gDNA和5’调控区，通过结构分析、多重比对和进化树分析，确认Sp-VIH属于CHH家族II型成员。gDNA由2个外显子和1个内含子组成，外显子和内含子之间并不遵循典型的“GT-AG”规则，可能是无脊椎动物中一种新的选择性剪切形式。Sp-VIH基因仅在眼柄中表达，且随着卵巢发育的成熟表达量逐渐减少，说明了我们所获得的Sp-VIH是抑制卵巢发育的重要神经肽基因。我们也对ERK通路、Cyclin-CDK-CKI系统、SUMO化通路、UPP通路及抗氧化系统等生殖调控通路中27个重要基因进行了全长基因的克隆，基因结构的分析，多重比对和进化树的构建，定量PCR分析了它们在各组织器官的表达，在性腺（眼柄）各发育阶段的表达谱。原位杂交分析了通路中核心分子在配子发生中的细胞定位。初步分析了VIH 5’上游调控区的转录因子并构建相互之间的作用网络；ERK通路和VIH的作用网络；ERK通路，Cyclin-CDK-CKI通路，UPP通路和SUMO化通路之间的作用网络。此外，我们还进行了青蟹卵巢原代细胞培养的尝试并取得了重要的突破。本课题取得的成果为进一步开展青蟹性腺发育的研究提供了丰富的分子资源，为深入阐释青蟹性腺发育的调控奠定了基础。本课题发表了14篇论文，其中SCI论文7篇。较好地完成课题预定的目标。