基于线性双链DNA与门逻辑基因线路的合成生物学新方法的开发与应用

By introducing engineering principle into biology, synthetic biology aims to address the challenging issues, such as healthcare, environmental protection and energy. The development and application of novel elements and methods will promote the development of synthetic biology. Our preliminary results showed the successful construction of linear-double-stranded DNA (PCR amplicon) based AND logic calculation genetic circuits. Taking 2~3 different PCR amplicons (split from gene expression sequences) as inputs, our novel genetic circuit design principle achieves low noise-signal ratio AND gate calculation. Basing on these preliminary results, current project will focus on the following aspects: 1) to construct 2-input or 3-input AND logic genetic circuits in vitro and in vivo; to establish a novel synthetic biology tool for this project. 2) to improve the AND gate output signal through transfection condition optimization and double-stranded DNA chemical modifications; to explore genes involved in this AND gate calculation. 3) to analyze nucleotide(s) insertion or deletion at the junction between double-stranded DNA molecules; to construct linear-double-stranded DNA based AND gate calculation-based engineering antibody library. This project will bring novel elements and methods to synthetic genetic circuits design and provide novel strategies for new protein genesis.

通过将工程学思想引入生物学，合成生物学旨在解决人类面临的健康、环保和能源等问题。新元件和新方法的开发与应用将推动合成生物学快速发展。申请人前期以线性双链DNA（PCR扩增产物）为元件在细胞及动物水平成功构建了与门逻辑基因线路。通过PCR反应将基因表达序列拆分成2~3个线性双链DNA分子以作为输入，新基因线路实现了低噪信比与门逻辑运算。在此基础上本课题拟开展以下研究：1）在不同细胞系及动物水平实现2输入、3输入与门逻辑运算，为建立一种基于线性双链DNA与门逻辑基因线路的合成生物学新方法提供依据；2）通过优化转染条件及双链DNA化学修饰提高与门运算输出信号，并在基因水平寻找可影响DNA连接效率的调控因子；3）分析DNA分子连接处的碱基插入缺失情况，利用线性双链DNA与门运算构建工程抗体库。本研究的完成将为合成生物学基因线路设计带来全新的元件与方法，同时为新蛋白生成提供新策略。

合成生物学以工程化的设计理念，对生物元件、系统进行有目标的设计、改造乃至重新合成，帮助人类解决健康、环保和能源等问题。哺乳动物细胞系在合成生物学研究中扮演着重要角色：既是重要的底盘细胞（如治疗性抗体的生产），也可作为多种重大疾病的研究模型，同时也是GPCR、离子通道、TCR等跨膜蛋白的最佳研究平台。本项目以基于线性双链DNA与门逻辑基因线路构建策略的开发为起点，聚焦哺乳动物细胞系高丰度DNA文库构建这一技术瓶颈问题开展了系列研究。1、利用NHEJ机制线性双链DNA与门逻辑基因线路在哺乳动物细胞系内构建瞬时表达高丰度肽库，并结合哺乳动物双杂交系统成功筛选到了MDM2的相互作用肽；2、开发出HR机制线性双链DNA与门逻辑基因线路，在此基础上开发出纳米抗体库的瞬时表达策略：dsDNA-HR，使哺乳动物细胞抗体文库的丰度达到百万级；3、开发出in-vitro-ligation纳米抗体库构建策略，深度测序结果显示纳米抗体丰度可达百万级；4、将piggyBac系统与in-vitro-ligation文库制备策略相结合，开发出基因组稳定整合文库策略，并开展系列发色团筛选验证实验。总之，我们建立起基于NHEJ和HR两种不同机制的线性双链DNA与门逻辑基因线路的构建策略，在此基础上在哺乳动物细胞内成功构建了瞬时表达高丰度肽／抗体文库。此外，通过与piggyBac系统相结合我们还建立起in-vitro-ligation和in-vitro-ligation-PCR两种哺乳动物细胞稳定整合文库构建策略。项目的顺利完成，将为哺乳动物细胞中功能蛋白分子的筛选与优化提供丰度更高的筛选起点，充分发挥哺乳动物细胞在跨膜蛋白、疾病相关蛋白、反式调控元件研究中的优势，同时为合成生物学新生物元件、新工具分子的开发提供支持。