ceRNA调控分子群在胆囊癌细胞转移可塑性中的分子机制研究

One of the major reasons of the poor prognosis is the recurrence and metastasis after surgery in gallbladder cancer. The regulatin of cell plasticity plays a key role in tumor metastasis. Based on the forepassed studies, our research group has realized that more complete understanding of the RNA regulatory networks is crucial to clarify the mechanism of the tumor metastatic heterogeneity in gallbladder cancer. RNAs can regulate each other through their ability to compete for microRNA and these RNAs with similar functions constitute a molecule group of competing endogenous RNA (ceRNA). In our previous work, we found that Zinc finger X-chromosomal protein (ZFX) is a key functional gene regulating the cell plasticity of metastasis in gallbladder cancer, whose expression is significantly up-regulated in the cancer tissues and the metastasis lesions. Furthermore, we found that ZFX can promote the epithelial-mesenchymal transition of gallbladder cancer. By analysis of the miRNAs that bind to 3' -untranslated region (3' UTR) of ZFX, we found that eleven members of Zinc-finger family of proteins and thirteen effector molecules in matastatic signal pathway are the ceRNA of ZFX gene on the base of the sharing mechanism of miRNAs. It suggests that ZFX and other members of Zinc-finger family of proteins constitute a molecule group by the regulation of ceRNA. To prove this hypothesis, we have proved one of ceRNA candidates called nemo-like kinase (NLK) can be modulated by the expression of ZFX. In the further investigation, we try to uncover the functional role and regulation mechanism of ZFX ceRNA，which will contribute to the understanding the mechanism of tumor metastatic plasticity in gallbladder cancer.

复发转移是胆囊癌预后差的主要原因，解析肿瘤细胞发生转移的分子机制是目前研究的重点。课题组在以往工作的基础上，认识到RNA调控作用贯穿了功能基因介导转移发生的各个环节，一条编码基因的mRNA可以通过竞争小RNA（miRNA）的方式调控其他功能性mRNA，构成功能相似，彼此调控的竞争性内源RNA（ceRNA）分子群。前期工作中，我们证实锌指蛋白ZFX是影响胆囊癌转移过程的关键分子，可促进胆囊癌细胞侵袭转移和EMT转化。通过生物信息学预测与实验分析，我们发现了包括ZNF148在内的11个ZFX锌指蛋白家族成员是ZFX的ceRNA。通过我们的前期验证实验，发现ZFX与ZNF148的表达存在miRNA依赖的正相关性。由此表明ZFX可以与家族其他成员之间通过ceRNA调控构成一个分子群。本项目拟完成ZFX ceRNA在介导肿瘤细胞转移过程调控中的作用与机制的研究，以拓展对胆囊癌转移过程分子基础的认识。

胆囊癌是胆道系统最常见的恶性肿瘤，其早期诊断困难，预后极差，复发转移是其最主要的死亡因素。胆囊癌细胞的转移过程是一个复杂的细胞学现象，涉及一个庞杂的分子网络和信号调控机制。因此，从分子网络调控的角度研究胆囊癌细胞发生转移的机制对改善其诊断和治疗水平具有重要意义。ZFX属于锌指蛋白家族，在胆囊癌肿瘤组织及转移灶中特异性高表达，是影响胆囊癌细胞转移的关键基因。本研究通过网站预测和基因芯片生物信息学分析，筛选出ZFX的ceRNAs和与其竞争性结合的miRNAs，预测了E2F7为ZFX的ceRNA，而miR-30a-5p可能是调控ZFX和E2F7的上游因子。在胆囊癌细胞中，过表达ZFX的3’UTR区，E2F7表达上调，敲减ZFX后，E2F7表达下调，同样敲减E2F7后，ZFX表达也下调，验证了两者之间的ceRNA分子网络关系，ZFX与E2F7表达呈正相关。在胆囊癌细胞中过表达miR-30a-5p后，ZFX和E2F7在mRNA和蛋白水平上表达均下调，双荧光素酶报告基因实验证实，miR-30a-5p可直接靶向于ZFX和E2F7。机制研究发现，上调miR-30a-5p和下调ZFX、E2F7可以有效抑制EMT信号转导通路的激活，从而引起相关蛋白的改变。E2F7在胆囊癌组织中高表达，且表达量与患者的组织学分化程度、周围组织浸润及切缘情况有关。E2F7高表达提示患者预后不良。前期课题研究中发现ZFX在胆囊癌组织中也呈高表达，说明ZFX和E2F7在胆囊癌组织中的表达也是正相关的。下调E2F7基因后，胆囊癌细胞增殖、侵袭和转移能力均受到抑制，且诱导胆囊癌细胞发生G0/G1期阻滞，上调E2F7后得到了相反的结果。miR-30a-5p在胆囊癌组织中表达量明显低于癌旁组织，且在伴有淋巴结转移的患者中，其表达量更低。miR-30a-5p表达量与患者的肿瘤大小、肿瘤浸润深度、淋巴结转移情况、病理分期有关，低表达提示患者预后不良，且miR-30a-5p是影响胆囊癌预后的独立危险因素。体内及体外实验表明，胆囊癌细胞转染miR-30a-5p后其增殖及转移能力明显减弱。综上所述，ZFX和E2F7可能通过竞争性结合miR-30a-5p影响EMT信号通路，进一步介导胆囊癌细胞转移过程的调控，加深了对胆囊癌转移过程相关特征性的分子调控网络的理解。