胆囊癌细胞亚群的克隆分选及异质性分析

肿瘤干细胞在肿瘤复发、转移中有重要作用；本项目组已在国家自然科学基金资助下分离出具有高转移潜能的胆囊癌细胞亚群，发现高转移潜能细胞亚群不同于其他细胞亚群的生物学与遗传学特征；推测在高转移潜能的胆囊癌细胞亚群中可能存在肿瘤干细胞的富集，因此表现为较高的转移倾向。本研究拟对胆囊癌高转移亚群GBC-SD/M3经过克隆分选和SP分选获得4种克隆集落，采用RayBiotech抗体芯片检测克隆集落的蛋白表达谱特性。基因芯片检测结合生物信息学数据分析克隆集落之间的细胞因子表达，选择出相关的重要的分子组群共性部分。FACS分选获得细胞群，并经体内外实验鉴定其具有肿瘤干细胞的特性。通过分析克隆集落表面分子标志物组群的共性分子，可以选择确立胆囊癌干细胞样细胞的特异表面标志物。研究结果将有利于阐述不同克隆集落转移过程中功能基因组表达模式的变化规律，深入理解转移本质，为胆囊癌的分子靶向治疗提供理论依据和实验基础。

胆囊癌恶性程度高，预后差，是一种严重威胁人民群众身体健康的疾病。导致胆囊癌预后差的主要原因是因为胆囊癌术后经常出现的复发转移现象，因此深入研究胆囊癌的复发转移机制，对于最终攻克胆囊癌，提高胆囊癌病人的预后具有重要的临床意义。为了研究胆囊癌细胞内的转移机制，我们通过体外转移小室实验筛选到了具有高转移潜能的胆囊癌细胞株GBC-SD-I-2 和SGC-996-MI-2 细胞。并通过体外的MTT 实验，克隆形成实验，转移实验和侵袭实验，验证了高转移潜能胆囊癌细胞株GBC-SD-I-2 和 SGC-996-MI-2 相对于其母本细胞GBC-SD 与 SGC-996 具有不同的生物学特性。Western 实验发现，在高转移潜能细胞株中，肿瘤干细胞的marker CD133 的表达明显增高，提示在高转移潜能胆囊癌细胞株中，肿瘤干细胞的比例明显提高，这可能是导致胆囊癌病人术后发生复发转移的主要原因之一。随后，我们通过生物芯片，检测了在高转移潜能胆囊癌细胞株及其母本细胞中，基因表达的差异，获得了在不同转移潜能细胞中表达具有显著差异的候选分子群。从这些差异基因中，我们发现NLK/ZFX/HMGB1等分子在高转移潜能胆囊癌细胞株中表达显著上升。功能学实验也显示细胞内敲减NLK 和ZFX 后，细胞的转移能力受到抑制。如果用丙酮酸乙酯（ethyl pyruvate，EP，一种HMGB1的抑制剂）抑制HMGB1信号通路，同样可以抑制胆囊癌细胞的转移，并诱导细胞发生凋亡。上述结果提示，在细胞内敲减NLK/ZFX分子或者抑制HMGB1，可以作为抑制胆囊癌转移的潜在分子靶点。由于胆囊癌在早期没有明显的症状，很多患者被确诊时已经无法进行根治性切除。因此，如何治疗晚期胆囊癌病人，是一个重要的研究课题。祖国的中医药宝库为我们提供了取之不竭的药物资源。我们建立了体外的药物筛选平台，通过此实验平台，我们发现Wogonin可以增加maspin 基因表达水平并进而抑制胆囊癌细胞的运动能力和侵袭转移能力。在此药物筛选平台基础上，我们还发现，cirsimaritin和matrine对胆囊癌细胞有显著地诱导凋亡的作用，并阐明了介导这一功能的分子机制。通过以上这些研究结果，加深了我们对于胆囊癌细胞转移过程的认识，为我们针对胆囊癌的侵袭转移过程设计特异性的靶向药物提供了有效的分子靶点，同时阐明了中药有效成分抑制胆囊癌转移的