细胞膜胆固醇对甘氨酸受体的调节机制的研究

Cholesterol plays very important roles in the central nervous system (CNS) and is related to several neurological diseases. As a critical component of lipid raft microdomains, the plasma membrane cholesterol can critically regulate the neuronal physiological function of many ion channels, including Na+, K+, Ca2+ channels and some ligand-gated ion channels (LGICs, i.e. NMDA and GABAA receptors). As an important member of LGICs, glycine receptors (GlyRs) can mediate fast inhibitory synaptic transmission and play roles in several important physiological and pathological processes such as neuromotor activity, pain sensation, the reward mechanism of drug abuse, cognition and anxiety control. Our previous studies have recently identified the molecular and cellular mechanism underlying the modulation of drugs, especially cannabinoids, on the function of GlyRs in the CNS. However, little is known about the role of membrane cholesterol in the mechanism of cannabinoid action on GlyRs. This project is to study the involvement and mechanism of neuronal membrane cholesterol in the modulation of GlyRs, by systematically applying a variety of advanced experimental techniques at the molecular and cellular level and up to animal behavior, including molecular biology, electrophysiology, immunohistochemistry, electron microscope, animal behavior tests and drug design.

神经细胞膜上的胆固醇参与调节很多离子通道的功能（如钠、钾、钙通道以及一些配体门控型离子通道），与众多神经系统疾病有密切的联系。甘氨酸受体是中枢神经系统非常关键的抑制性离子通道受体之一，受到很多药物（如大麻素等）的调节，从而影响一些重要的生理功能（如运动、感觉、认知、焦虑、成瘾等）。然而，作为细胞膜上一种重要的离子通道蛋白，甘氨酸受体的功能以及药物对其调节作用是否受到细胞膜胆固醇的影响目前尚不清楚。因此，本课题组拟通过分子生物学、电生理（单细胞、脑片、在体等）、免疫组织化学、电镜、动物行为学测量、小分子药物设计等实验方法，研究（1）在分子细胞水平，细胞膜胆固醇如何参与调节大麻素等药物与甘氨酸受体的相互作用；（2）在行为学水平，中枢胆固醇如何参与调控与甘氨酸受体相关的药物对动物行为（如痛觉、运动行为等）的影响。本项目的开展将为研究细胞膜胆固醇与配体门控型离子通道相互关系提供新的研究方向和思路。

甘氨酸受体是中枢神经系统中关键的抑制性离子通道之一，在脑干以及脊髓中大量分布。我们的前期研究发现大麻素可以增强甘氨酸受体的功能, α3甘氨酸受体参与大麻素的镇痛作用。在本研究中，我们利用转基因小鼠，电生理以及行为学等方法证明了α1甘氨酸受体同样参与大麻素的镇痛作用。通过计算机模拟，我们发现大麻素在甘氨酸受体上的作用位点为受体第三跨膜区域296位丝氨酸（S296），且该位点朝向膜脂质方向。胆固醇是细胞膜中含量丰富且具有重要生理意义的脂质。研究结果表明细胞膜胆固醇调控多种受体/离子通道的功能。我们通过电生理的手段在细胞水平上证明了细胞膜胆固醇调控大麻素对甘氨酸受体的增强作用。为了进一步证明体内胆固醇对大麻素调控甘氨酸受体的影响。我们通过给小鼠长期注射临床上使用的降脂药物辛伐他汀从而降低小鼠体内胆固醇含量。由于现有的技术手段很难直接的检测组织中特定区域的胆固醇水平，我们发展出酸化增强-质谱成像技术以及光辅助电喷雾解析电离质谱成像技术从而成功的对组织样品中胆固醇进行成像及分析。光辅助电喷雾解析电离质谱成像技术结果检测胆固醇的结果表明，长期辛伐他汀注射降低小鼠脊髓背角~20%胆固醇水平。结合电生理及行为学结果，我们证明了小鼠脊髓背角胆固醇水平与大麻素对甘氨酸受体的增强作用以及大麻素的镇痛作用均存在明显正相关关系。此外，我们还建立了单细胞质谱分析技术，实现了单个神经元层面对包含神经递质在内的多种小分子化合物的检测以及定量，用于检测胆固醇是否影响神经递质的传递以及小分子代谢等。