小麦高分子量谷蛋白亚基中间重复区近N-末端半胱氨酸残基与面筋弹性的关系研究

申请者已经获得小麦高分子量谷蛋白亚基1Dx5、1Ax1野生型基因的胚乳特异性表达载体及其导入小麦的转基因株系。在此基础上，本课题拟采用重叠延伸PCR法，分别对1Dx5、1Ax1野生型基因进行定点突变：1Dx5亚基中间重复区近N-末端的Cys残基由Ser残基替换、1Ax1亚基相应位置的Ser残基由Cys残基替换；进而，应用基因枪轰击法，分别获得稳定表达外源1Dx5、1Ax1突变型亚基的转基因小麦；通过外源野生型1Dx5、1Ax1亚基与其对应突变型亚基间的功能比较，分别揭示1Dx5亚基替换消除中间重复区近N-末端Cys残基和1Ax1亚基替换添加该Cys残基影响面筋弹性的真实效应。综合以上结果，将阐明该特定Cys残基与面筋弹性的关系，补充和完善小麦高分子量谷蛋白亚基与面筋弹性关系的分子机制；也为基因定点突变法创造优异基因资源及其应用于小麦加工品质改良的研究，提供科学依据。

本项目的研究目的是揭示小麦HMW-GS中间重复区近N-末端额外Cys残基与面筋弹性的关系。通过PCR法对1Ax1亚基基因进行了定点突变，将1Ax1亚基中、对应于1Dx5亚基中间重复区额外Cys残基位置的丝氨酸突变为半胱氨酸，选择胚乳特异性启动子，构建了1Ax1突变基因的真核表达载体；运用基因枪法将突变基因转化小麦品种L88-31，获得了转基因材料，Southern blotting分析表明外源1Ax1突变基因拷贝数2-4个，SDS-PAGE分析表明突变基因能够稳定正确表达。经过连续三代（T0-T3）的筛选，获得了3个1Ax1突变基因的转基因纯合株系。与受体对照L88-31相比，过表达的1Ax1突变基因提高了转基因株系的SDS沉降值、面团弹性、耐揉性和抗延展性；而与1Ax1野生型基因的转基因小麦相比较，外源1Ax1突变基因对面团弹性等的贡献小于1Ax1野生型基因的贡献，这与基于面筋弹性假说的预期结果相反。由此提出新的假设：这种1Ax1突变基因对面筋弹性的正向效应小于1Ax1野生型基因，可推测是由于额外Cys的存在改变了分子间二硫键的分布方式，进而减少了末端-末端分子间二硫键的数目，本研究结果有助于进一步解析面筋弹性的形成机制。