小麦高分子量麦谷蛋白亚基基因的转录调控解析

The high-molecular-weight glutenin subunit (HMW-GS), as a major component of seed storage protein (SSP) in wheat, largely determines the processing quality. The primary structure of gene coding region, composition and individual contribution of HMW-GS to processing quality have been extensively studied, however, its molecular regulatory mechanism remains unknown. HMW-GS synthesis, just as other SSP, is primarily controlled both spatially and temporally at the transcriptional level, so it is very significant to reveal the transcriptional regulatory mechanism of HMW-GS genes for the construction of molecular model regulating SSP and the improvement of wheat quality. Transcriptional regulation is implemented through the interactions between cis-acting elements and trans-acting factors (transcription factors). The objective of this project is to perform systematic and integrative analysis on functional cis-acting elements and transcription factors targeting HMW-GS gene transcription. Our proposed research are to: (1) in silico identify conserved regions and cis-acting elements of wheat HMW-GS gene promoters based on the comprehensive analysis of PLACE, Plantcare and Plantpan in combination with the findings of seed protein gene transcriptional regulation in the rice, maize and Arabidopsis etc., (2) find out functional regulatory regions and corresponding functional cis-acting elements by region-directed and site-directed mutagenesis in combination with transgenic and histochemical experiments, (3) identify transcription factors targeting functional cis-acting elements by Yeast One-Hybrid screening, Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) and transient-expression experiments, and (4) clarify the function of transcription factors by transgenic experiments.

小麦高分子量麦谷蛋白亚基（HMW-GS）是储藏蛋白的主要成分，对加工品质有重要影响。HMW-GS基因编码区的遗传变异已广泛研究，但其表达调控研究还很少。储藏蛋白表达主要通过转录来调控，系统研究HMW-GS基因转录调控机理不仅能为储藏蛋白表达调控提供基本分子模型，而且还可为有目的地调控HMW-GS表达来改良小麦品质提供理论依据。基因转录调控是通过顺式作用元件和转录因子互作来实现的，所以本项目拟开展如下研究：（1）利用PLACE等启动子分析数据库并结合水稻和拟南芥等种子蛋白基因转录调控的研究结果，系统鉴定小麦HMW-GS基因启动子的保守区段和顺式作用元件；（2）利用逐段缺失和定点突变结合转基因和组织化学技术鉴定HMW-GS基因启动子的功能区段及其功能顺式作用元件；（3）利用功能顺式作用元件进行酵母单杂、电泳迁移率变动分析和体内瞬时表达鉴定相应的转录因子；（4）利用转基因技术验证转录因子功能。

高分子量麦谷蛋白亚基（HMW-GS）是小麦贮藏蛋白（SSP）的重要组成部分，决定面团强度和弹性。HMW-GS由Glu-1基因编码，主要受转录水平因素调控。在模式植物中已发现多种调控SSP基因表达的顺式作用元件（Cis motif）和转录因子（TF），而小麦Glu-1转录调控机制尚缺乏系统研究。本研究从调控Glu-1表达的cis motif和TF两个方面展开，主要结果如下：. 根据文献报道和PLACE数据库分析，在10个Glu-1基因1-kb启动子区发现30个保守Motif，它们集中分布于三个保守调控区段（CCRM）内：–950至–750（CCRM3）、–650至–400（CCRM2）和–300至–101（CCRM1）。采用逐段缺失的方式，将CCRM在Glu-1启动子逐个去除并插入pUbi-GUS载体GUS报告基因上游。利用农杆菌介导方法获得小麦稳定转基因株系，通过检测GUS表达的组织特异性和表达活性验证CCRM的调控功能。GUS染色、qPCR及GUS酶活性分析表明，CCRM2和CCRM3可分别提高成熟种子GUS酶活性4和6倍，但它们不参与调控Glu-1表达的胚乳特异性，300-bp（含CCRM1）Glu-1启动子足以保证基因在胚乳中特异表达， 并且足于维持Glu-1基因精确起始。对300-bp启动子功能分析发现，CCRM1内CCRM1-2（–300至–209）仅控制Glu-1表达水平。CCRM1内CCRM1-1（–208至–101）对Glu-1表达至关重要，它不仅调控基因表达水平，而且是维持Glu-1胚乳特异表达的核心区段。. 选择CCRM2作为诱饵序列，通过酵母单杂交筛选到一个NAC转录因子TaNAC100。TaNAC100具备NAC蛋白保守结构域且定位于细胞核。系统进化分析表明，TaNAC100与调控植物发育的NAC蛋白聚为一类。TaNAC100可在小麦多个组织表达，其中种子、叶鞘和根中表达量较高。烟草转录激活实验表明，TaNAC100可在烟草中降低Glu-1表达活性。在小麦中过表达TaNAC100未显著影响对农艺性状，但可显著降低种子总蛋白含量，其中降低种子HMW-GS、LMW-GS和醇溶蛋白分别11-38%、7-11%和28-29%。本研究不仅有助于揭示Glu-1的转录调控机制，而且为在转录水平改变种子HMW-GS含量奠定了理论基础。