小麦谷蛋白以外的储藏蛋白 Avenin-like b 影响面筋弹性的作用机理

We have found the significant positive impact of the rich-cysteine storage protein Avenin-like b in wheat on dough elasticity by the gene transformation method. The fact that the wheat Avenin-like b proteins cannot be grouped into wheat glutennin raised the question on the widely-held view that the only glutenin subunits could form the glutenin polymers via inter-chain disulphide bonds and determine the gluten elasticity. In this project, the gene site-direct mutation, the incorporation of the mutative Avenin-like b proteins into wheat dough by an in vitro assay and the genetic transformation of the mutative avenin-like b genes into wheat plants will be carried out to study the effect of the non-conserved cysteine residues of wheat Avenin-like b proteins on the formation of storage protein polymers and dough elasticity, in order to tesify the hypothesis that Avenin-like b proteins could be present in the polymers via inter-chain disulphide bonds and result in the impact on the dough elasticity in wheat. So, this project will gradually reveal the mechanism of the effect of wheat Avenin-like b proteins on the dough elasticity, and provide the experimental evidence to support the existence of non-glutenin storage proteins which play a role in contributing to the dough elasticity by their cross-linking into the storage protein polymers, and so, help to further understand the construction of dough elasticity in wheat.

申请者已经应用转基因过量表达的方法，确证了小麦富含半胱氨酸（Cys）残基的储藏蛋白Avenin-like b，具有增强面筋弹性的显著效应。由于小麦Avenin-like b蛋白不属于谷蛋白，因此只有谷蛋白才能通过分子间二硫键、形成面筋蛋白聚合体、最终决定面筋弹性的假说，便出现了疑问。本项目将综合运用基因定点突变、体外蛋白质掺粉和转基因过量表达的方法，研究小麦Avenin-like b蛋白中最有可能形成分子间二硫键的非保守性Cys残基，对面筋蛋白聚合体与面筋弹性的影响效应；验证"小麦Avenin-like b蛋白，可通过分子间二硫键，参与面筋蛋白聚合体的形成，最终影响面筋弹性"的假设；由此解析该类蛋白质影响面筋弹性的作用机理，为"在小麦储藏蛋白中，存在谷蛋白以外的组分，可通过分子间二硫键参与面筋蛋白聚合体的形成，最终影响面筋弹性"的新观点提供证据，补充和完善小麦面筋弹性形成机制的假说。

采用长引物PCR结合DNA片段人工合成的方法，获得了Cys数目与分布发生变异的八种非典型储藏蛋白Avenin-like b基因的突变体，构建了原核与真核表达载体。通过突变基因的功能预测，选用其中五个突变基因，采用基因枪法进行小麦遗传转化。通过两年多批次的小麦转化操作，分别获得了每个突变基因的多个独立转化的阳性植株。采用PCR、Southern blot、SDS-PAGE和Western blot等方法，检测T0阳性植株的外源基因整合与表达。田间栽培结合人工生长室栽培，采用系谱法繁育后代，选育转基因小麦T0至T5代。继续采用上述方法，逐代检测，在T5代中，获得了各种突变基因的小麦转基因纯系。采用10-g Mixograph方法，测定面团粘弹性，发现突变型Avenin-like b蛋白的强筋效应的顺序为：第2和第18位置都存在Cys残基＞第2或第18位置存在Cys残基＞第2和第18位置都不存在Cys残基的Avenin-like b蛋白，表明非保守性的第2和第18位置上的Cys残基存在与否，直接影响Avenin-like b蛋白的弹性效应。继而检测比较面筋强度形成机理的有关性状，结果发现：第2和第18位置上的Cys残基，通过影响分子间二硫键的相对含量，而影响面筋大聚合体的含量与分布，进而影响面筋的次级结构，最终影响面筋弹性。表明第2和第18位置上的Cys残基，使得小分子的Avenin-like b蛋白与谷蛋白亚基间形成分子间二硫键，作为“分子桥梁”促进了谷蛋白亚基聚合体的形成，最终影响面筋的粘弹性。本研究达到了预期目标，补充了小麦加工品质的形成机理，并为Avenin-like b基因的育种应用提供了进一步的依据。