活细胞内G-四链体结构稳定性的测量方法及其在抗癌药物筛选中的应用研究

G-quadruplexes are unique secondary structures formed by G-rich DNA or RNA sequences. G-quadruplexes, which are common in biologically important regions such as telomeres and oncogenes, are considered as the important potential anticancer drug targets. It is significant to characterize G-quadruplex structural stability because one of the important strategies of current anticancer drug design is to improve the stability of G-quadruplex structure by ligands. More and more researches have shown that G-quadruplex structural stability can be significantly affected by cellular environment. However, G-quadruplex structural stability is hardly characterized in living cells due to the lack of high sensitive method. It is urgent to develop a new method to measure G-quadruplex structural stability in living cells. 19F nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy is a powerful tool to investigate G-quadruplexes structural stability in living cells. In this project, we mainly use tetramolecular telomeric G-quadruplexes from Tetrahymena, bimolecular telomeric G-quadruplexes form Oxytricha nova and intramolecular telomeric G-quadruplexes from human as the research objects, deliver them into Xenopus laevis oocytes and mammalian cells, and develop a measurement method of G-quadruplex structural stability in living cells by investigating their structural stability in different cells by using 19F NMR. The method will be applied to anticancer drugs screening that aims to target G-quadruplexes.

G-四链体是具有连续鸟嘌呤序列的DNA或RNA形成的特殊核酸二级结构，它广泛分布于端粒、致癌基因调控区，被认为是重要的抗癌药物靶点。稳定G-四链体结构是当前抗癌药物设计的重要策略之一，在体外多种方法可以表征G-四链体结构稳定性，然而在细胞内原位表征其结构稳定性尚缺乏高灵敏高特异性方法。许多研究表明天然细胞环境会很大程度上影响G-四链体的结构稳定性，因此亟需发展细胞内表征G-四链体结构稳定性的新方法。19F核磁共振波谱是细胞内G-四链体结构稳定性表征的有力工具。本项目中我们以四膜虫、尖毛虫及人的端粒重复序列等为研究对象，将这些G-四链体核酸引入到爪蟾卵母细胞及哺乳动物细胞中，主要利用19F核磁共振波谱研究它们在不同细胞内结构稳定性，发展活细胞内原位测量G-四链体结构稳定性的高灵敏高特异性方法，并利用该方法找出影响结构稳定性的重要因素，为G-四链体为靶点的抗癌药物筛选提供活细胞内原位筛选方法。

G-四链体是具有连续鸟嘌呤序列的DNA或RNA形成的特殊核酸二级结构，它广泛分布于端粒、致癌基因调控区，被认为是一种重要的抗癌药物靶点，同时具有G-四链体结构的核酸也是重要的潜在药物，因此在细胞内原位研究G-四链体结构的稳定性具有重要意义。许多研究表明细胞环境会很大程度上影响G-四链体的结构稳定性，然而，由于缺乏高灵敏高特异性方法，细胞内G-四链体的结构稳定性很难获取，因此亟需发展细胞内测定G-四链体结构稳定性的新方法。19F核磁共振波谱是细胞内G-四链体结构稳定性表征的有力工具。本项目中我们以人血管内皮生长因子启动子hVEGFP、人端粒、人凝血酶核酸适配体TBA等为研究对象，将这些G-四链体核酸通过显微注射或电穿孔引入到爪蟾卵母细胞以及哺乳动物细胞中，利用19F核磁共振波谱研究了它们在不同细胞内的结构稳定性，建立了细胞内原位测量 G-四链体结构稳定性的19F NMR方法，并找出了影响结构稳定性的重要因素。研究发现，G-四链体核酸在细胞内的稳定性与细胞类型，以及核酸自身在细胞内的五级相互作用紧密相关。在大肠杆菌、酵母和卵母细胞中的结构稳定性高于在哺乳动物细胞中的稳定性。在非癌细胞中的结构稳定性普遍大于在癌细胞中的稳定性，特定G-四链体核酸在细胞内的五级相互作用越强其在细胞内稳定性越高。另外，我们现有的研究结果提示细胞环境会明显削弱G-四链体核酸在细胞内与配体的相互作用。这些结果使我们对G-四链体核酸在细胞内的稳定性有了规律性认识，这对G-四链体相关的药物开发具有重要指导意义。