编码二磷酸腺苷葡萄糖焦磷酸酶的OsAGPase3基因在水稻缺氮和缺磷胁迫响应中的功能研究

Nitrogen (N) and phosphorus (P) are often limiting factors in soil for plant growth and development. It has been reported that a large number of genes are involved in plant responses to N and phosphate (Pi) starvation stresses. Besides, increasing lines of evidences suggest the crosstalk between nutrient starvation signaling (i.e. N and Pi starvation signaling) and carbon (C) signaling. In our previous work, a N and Pi starvation-responsive gene encoding adenosine diphosphate-glucose pyrophosphorylase (AGPase), which is responsible for the biosynthesis of starch in rice (Oryza sativa), was isolated, and designated as OsAGPase3. A mutant line of OsAGPase3 showed disrupted responses to N starvation and accumulation of P. In the present work, both OsAGPase3 mutants and overexpression lines will be used for functional characterization of this gene in response to N and Pi starvation stresses. In addition, bimolecular fluorescent complementation, measurement of in vitro and in vivo protein activity, as well as microarray analysis will also be utilized. We believe that we stand a good chance to elucidate the pivotal role and underlying molecular mechanism of OsAGPase3 in N and Pi starvation signalings and their crosstalk with C signaling, providing candidate genes for molecular breeding of crops with high N- and P-use-efficiency.

氮和磷是植物生长发育的重要限制因子。近年来对植物氮磷信号转导途径的研究表明，众多基因参与植物对缺氮和缺磷环境的适应性机制，并且氮磷信号转导途径与包括碳代谢途径在内的其他途径存在交互作用。申请人前期工作从水稻中筛选到了一个参与氮磷缺乏胁迫下淀粉合成相关基因，其编码二磷酸腺苷葡萄糖焦磷酸酶，并暂将其命名为OsAGPase3。初步结果显示，该基因突变影响水稻对缺氮胁迫的响应和磷素积累。本项目拟利用OsAGPase3过量表达和突变体植株，同时采用BiFC、蛋白体内和体外活性检测、基因芯片等手段，挖掘OsAGPase3在水稻缺氮和缺磷胁迫响应中的功能。本研究有望阐明水稻中首个参与维持氮磷动态平衡的二磷酸腺苷葡萄糖焦磷酸酶的生理功能及其分子机制，为水稻养分缺乏信号转导途径和碳代谢途径的交互作用的研究提供理论依据，同时为培育氮磷高效作物提供候选基因。

氮和磷是植物生长发育必需的最为重要的两个大量元素。近年来对植物氮磷营养的生理与分子机制研究表明，氮磷缺乏往往伴随着淀粉和可溶性糖积累的改变，表明植物碳氮、碳磷代谢过程存在着交互作用。本项目前期研究中筛选到了一个负责编码淀粉合成的腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸酶的基因OsAGPase3，发现该基因在转录水平受缺氮和缺磷胁迫强烈上调表达。本项目通过转基因获得OsAGPase3基因的过表达及突变体植株，同时采用了BiFC、蛋白体内和体外酶活研究、转录谱高通量测序等手段，阐明了OsAGPase3基因参与维持氮磷动态平衡的生理功能并筛选到了调控该过程中的关键基因。通过其内源启动子驱动GUS报告基因，分析了该基因在不同氮磷营养条件下的时空组织表达特征。亚细胞定位结果显示，该基因在叶绿体中强烈表达。BiFC结果显示，OsAGPase3和其同源基因OsAGPase6可以共定位到叶绿体并形成蛋白的复合体。大肠杆菌异源回补实验表明该基因和OsAGPase6形成的蛋白复合体确实具有腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸酶的活性。生理实验结果表明，该基因的突变导致了水稻植株在缺氮和缺磷胁迫下在叶鞘中积累淀粉减少，进而导致在全营养和缺氮条件下突变体叶鞘中蔗糖含量升高。对突变体材料的磷素含量和分配检测发现，与野生型相比，OsAGPase3突变体，其叶鞘中总磷及无机磷浓度在全营养和低氮处理下显著增加。利用RNA-Seq技术，对转基因材料转录谱进行检测，并利用荧光定量PCR加以验证，发现OsAGPase3突变材料中SPX2基因在全营养及低氮条件下表达受到抑制可能是导致磷素水平变化的重要原因。综上所示，本研究揭示了OsAGPase3基因通过影响水稻淀粉的合成进而影响了光合产物的分配。该基因的突变会抑制水稻全营养及低氮条件下SPX2基因的表达进而影响水稻磷素的动态平衡。