采用CRISPR/Cas9系统敲除lncRNA-ORM基因规避血管内皮生长因子治疗缺血性卒中的副作用

Vascular endothelial growth factor (VEGF) promotes angiogenesis, axnol outgrowth and brain rehabilitation after ischemic stroke while it aggrevates blood-brain barrier (BBB) leakage and brain edema. The mechanisms underlying VEGF-induced vascular leakage were variable in previous researches, and we found 3 orosomucoids (ORM) genes closely related to VEGF-induced BBB breakdown after ischemic stroke via screening whole mouse genome microarray. ORM has been demonstrated to modulate the permeability of BBB and increase the expression of tight junction proteins to enhance BBB integrity in previous researches. Moreover, one study demonstrated that exogenously administered ORM could mitigate brain edema and improve stroke outcomes. Simultaneously, we explored the differences of long non-coding RNA (lncRNAs) expression profiles between VEGF+stroke group and stroke group, and found a lncRNA named lncRNA-ORM highly homologous to ORM1 gene. In vitro, lncRNA-ORM inhibition improved the levels of ORM mRNA and proteins, and impeded the down regulation of ORM induced by VEGF. This project is aimed to verify this conclusion in vivo, and targeting lncRNA-ORM via CRISPR/Cas9 to avoid the side-effect of VEGF in treating ischemic stroke.

血管内皮生长因子(VEGF)具有促进卒中后血管生成和脑组织修复的作用，但其同时具有加重卒中后血脑屏障(BBB)破坏的副作用。关于VEGF增加血管壁通透性的机制众说纷纭，而我们前期采用小鼠全基因组表达谱芯片探索了与VEGF增加BBB通透性相关的基因，筛选出3个血清类粘蛋白(ORM)基因，后者在以往的研究中已被证明与BBB密切相关，能减轻卒中后BBB破坏及神经功能缺损症状；我们同时探索了卒中后给予VEGF引起的长链非编码RNA(lncRNAs)表达谱的改变，筛选出与VEGF给药相关的lncRNAs，从中发现一个与ORM1基因高度同源的lncRNA-ORM。体外实验中证实抑制lncRNA-ORM可增加ORM的表达水平，且阻止VEGF引起的ORM表达下调。本研究欲在体内实验中证实这一结论并采用第三代基因编辑技术-CRISPR/Cas9敲除lncRNA-ORM以规避VEGF治疗缺血性卒中的副作用。

血管内皮生长因子(VEGF)可促进卒中后血管生成和脑组织修复，但亦可加重卒中后血脑屏障(BBB)的破坏。而关于VEGF作用于BBB的机制尚不清楚，我们的前期研究通过小鼠全基因组表达谱芯片检测了正常小鼠、脑梗塞小鼠以及脑梗塞后给药（VEGF）小鼠的全基因表达情况，探索了VEGF增加BBB通透性相关的编码基因（mRNA）以及长链非编码基因（lncRNA）。本研究利用CRISPR/Cas9系统在原代培养的小鼠神经细胞中敲除lncRNA-ORM，显著抑制了lncRNA-ORM的mRNA水平，显著升高ORM1基因表达水平，将培养上清液加入到小鼠星形胶质细胞和脑微血管内皮细胞共培养体系（血脑屏障细胞模型）中，可升高氧糖剥夺/富氧后的跨内皮电阻及减少HRP渗漏，提示减轻了缺血缺氧后血脑屏障的破坏。体内实验结果显示，在小鼠脑卒中前向侧脑室内注入慢病毒载体敲除lncRNA-ORM基因显著升高了ORM1的表达水平，并部分抑制卒中后外源性VEGF导致的血脑屏障破坏加重，但并未明显改善小鼠卒中后第7天的脑梗死体积及行为学评分。芯片结果中差异表达的lncRNA-HOXC13与其预测靶基因HOXC13，在脑卒中小鼠模型中给予VEGF后表达显著增加，在血脑屏障细胞模型中亦得到相似结果。在血脑屏障细胞模型中下调lncRNA-HOXC13可显著降低HOXC13的表达、升高紧密连接相关蛋白ZO-1、occludin、claudin-5的表达，且可部分逆转VEGF导致的HOXC13上调，同时升高氧糖剥夺/富氧后的跨内皮电阻及减少HRP渗漏，提示减轻血脑屏障破坏。综上，本研究验证了VEGF可通过影响多个lncRNAs而调控血脑屏障三层结构中的紧密连接、以及基底膜负电荷从而增加卒中后血脑屏障通透性，为规避VEGF治疗缺血性脑卒中的副作用提供新的思路及证据。