基于线粒体能量代谢激活研究大黄蛰虫丸逆转肝癌多药耐药机理

Activation of mitochondrial energy metabolism is involved in the formation of multidrug resistance (MDR) of chemotherapeutic drugs, leading to treatment failure of primary hepatocellular carcinoma (HCC). Based on literature research and previous experiments, we hypothesized that α-ketoglutarate (α-KG) -mediated ATP synthase activity alteration could be the core mechanism underlying the MDR of HCC. The current project will initially investigate whether metabolic changes of α-KG are directly related with ATP synthase activation and MDR of HCC in animals and cells. Specifically, through interfering with the key enzymes for α-KG metabolism in mitochondria, we will analyze the alterations in energy metabolism and MDR in order to identify the potential regulatory points for targeting α-KG. Then, we will use various agonists and inhibitors based on mitochondrial energy metabolism and biochemical and molecular biology techniques to study the possible mechanisms and targets for Dahuang Zhechong Wan effects on the α-KG metabolism-mitochondrial energy metabolism and ATP synthase activation in MDR of HCC. These studies would uncover the mechanisms for Dahuang Zhechong Wan reversal of MDR of HCC in terms of activation of mitochondrial energy metabolism, and provide therapeutic basis for clinical application of Dahuang Zhechong Wan for combating MDR of HCC.

线粒体能量代谢激活参与了化疗药物多药耐药（MDR），常导致原发性肝癌治疗失败，我们在文献研究及预实验基础上创新性提出 “α-酮戊二酸（α-KG）线粒体代谢变化致ATP合成酶激活是肝癌MDR重要机制” 的科研假说，计划首先在整体及细胞水平上明确线粒体α-KG与ATP合成酶激活及肝癌MDR间的直接相关性；再借助RNA干扰及信号通路工具药物，干预α-KG在线粒体积累及细胞浆转移过程，探究影响ATP合成酶及MDR的关键性α-KG代谢环节。在此基础上，依据寒凉中药在逆转肿瘤MDR中的重要地位及其抑制细胞能量代谢的相关研究进展，选择疗效确切、具有显著寒性特征的抗肝癌方剂大黄蛰虫丸，综合利用分子生物学、血清药理学、血清药物化学等研究手段，揭示其影响肝癌α-KG代谢、ATP合成酶活性及MDR的可能环节与靶点，期望从线粒体能量代谢激活角度解释其作用机制，为临床推广应用于逆转肝癌MDR提供理论依据。

本项目以肿瘤细胞能量代谢的异质性及可塑性为切入点，基于“线粒体能量代谢激活参与了肝癌细胞化疗药物耐药，α-酮戊二酸(α-KG)参与这一过程”的科研假说，在整体、细胞、分子水平上证明了：（1）α-KG代谢加速导致细胞氧化磷酸化水平显著提高，是肝癌SMMC-7721耐药细胞重要的代谢特征；（2）苹果酸-天冬氨酸穿梭功能的激活，是α-KG代谢加速的关键原因，同时解除了其对ATP合成酶及脯氨酸羟化酶的抑制作用，细胞呈现氧化磷酸化及糖酵解同时增强的能量代谢表型；（3）大黄蛰虫丸不仅能直接诱导耐药肝癌细胞凋亡，同时能影响多种能量代谢酶的表达，降低肿瘤细胞的能量代谢，一方面协助启动凋亡程序诱导肝癌细胞凋亡，另一方面抑制细胞正常的生理生化代谢以及防御功能，与阿霉素联用，能显著增加其在肝癌组织中的分布，协同发挥“消痞散结”的疗效。. 为进一步探索大黄蛰虫丸抑制能量代谢的物质基础，我们利用HPLC及UHPLC-Q-TOF-MS/MS技术，在客观表征大黄蛰虫丸药效物质特征基础上，以91种入血成分为主要研究对象，结合体内外实验研究，寻找了次黄嘌呤、大黄酸、大黄素、芦荟大黄素、汉黄芩素、汉黄芩苷等抑制细胞能量代谢的药效物质。. 本项目揭示了肝癌SMMC-7721耐药细胞的能量代谢变化特征及机制，为从能量代谢角度逆转肝癌耐药的研究提供了新的思路；从线粒体能量代谢角度探讨大黄蛰虫丸联合阿霉素逆转肝癌耐药的作用机制，为推广中西药联合治疗肝癌、逆转肝癌耐药提供了一个新的方向。本项目研究获得了预期的成果并发表了相关论文，实现了预期研究目标。