卵源因子Obox1促进卵子生成中的作用

Ovulatory dysfunction is the leading cause of female infertility, but the pathogenesis is not clear. The oocyte factors play an important role in folliculogenesis and oogenesis. In our previous studies, it is found that oocyte specific homeobox1 (Obox1) can markedly enhance the generation of induced pluripotent stem cells (iPSCs) by regulating epithelial specific genes and cell-cycle related genes expression. Obox1 exclusively in oocytes as early as one-layer follicles and throughtout folliculogenesis. We proposed that Obox1 may functions as a transcription factors promoting oogenesis by modeling meiosis and oocyte-granulosa cell junction. Using CRISPR-Cas9, we established Obox1 knockout mice and found that Obox1-null females were subfertile with a smaller ovaries, disasordered hormone and reduced ovulation compared to wild-type controls. The downstream candidate genes will be identified by RNA-seq of oocytes and follicular granule cells in different development stages. We will further investigate their functions in meiosis, proliferation and apoptosis of granulosa cells and expression of related hormone receptors by knockdown, overexpression and rescue experiments. The regulatory mechanism of obox1 on its downstream genes during oogenesis will be investigated. Our study will help us to understand the pathogenesis and provide the candidate therapeutic schedule.

排卵机能障碍是女性不孕的主要原因，其发病机制尚不明确。前期研究表明，Obox1通过对表皮特异性基因和细胞周期相关基因的转录调节，显著提高体细胞重编程的诱导效率。在卵泡发育中Obox1特异性表达于卵母细胞。我们提出科学假设，Obox1在卵母细胞的减数分裂调控和卵母细胞-卵泡颗粒细胞的细胞连接中起重要作用。利用CRISPR-Cas9技术，建立了Obox1基因敲除小鼠，发现其雌鼠卵巢小、排卵少、激素水平紊乱、生育力低下。拟通过对敲除小鼠不同发育时期的卵母细胞和卵泡颗粒细胞进行转录组测序分析，发现Obox1的下游调节基因。在卵母细胞中敲降和过表达、在Obox1敲除卵母细胞中进行挽救实验，检测其对卵母细胞减数分裂、卵巢颗粒细胞增殖和凋亡及相关激素水平表达的调控；明确Obox1对候选基因的调控机制，阐明在其卵子生成中的作用机制，为卵巢功能异常疾病的发病机理和临床治疗提供坚实的理论基础。

排卵机能障碍是女性不孕的主要原因，其发病机制尚不明确。Obox1是一个特异性表达于卵母细胞的转录因子，它从单层卵泡卵母细胞开始表达，直到受精后胚胎发育至2-细胞阶段急剧下降。前期的研究表明，其过表达可以促进体细胞重编程，其转录活性更倾向于转录抑制。本项目利用CRISPR-Cas9技术，构建了Obox1基因敲除小鼠，发现其生育力显著降低。通过体外培养体系，明确了Obox1基因敲除小鼠的卵母细胞并没有明显异常。通过系统地研究不同发育时期的卵巢转录组，发现早在一周龄小鼠中，卵巢信号分子表达已出现异常。进一步研究表明，Obox1基因敲除小鼠中，卵母细胞发育的关键因子、颗粒细胞中的重要转录因子以及关键的信号分子均显著升高。但发情间期的血清激素，包括雌激素（E2）、促卵泡生成素（FSH）和促黄体生成素（LH），水平显著降低；同时，卵巢的E2和LH水平也显著降低，尤其是LH。通过研究Obox1基因敲除小鼠对激素的响应性，我们发现其对LH的响应性显著降低，超数排卵后的卵巢中依然存在高比例的未排出卵母细胞的有窦卵泡。5周龄的小鼠卵巢中，黄体数量显著减少。注射hCG后10小时的卵巢样本中，Obox1敲除小鼠中被上调的基因主要富集在转录调节上。在hCG注射后48小时的小鼠血清孕激素水平显著降低。激素合成相关的关键酶Star、Cyp19a1、Hsd17b1以及Hsd17b7表达异常。总之，Obox1敲除小鼠卵巢激素合成相关的关键酶的表达发生了异常，对卵母细胞和卵泡发育的基因表达异常，致使其对LH的响应性降低，超数排卵处理后，未破裂的有窦卵泡增加，黄体生成减少，从而影响了Obox1敲除小鼠的生育力能力。该现象类似于人的未破裂卵泡黄素化综合征（LUFS）。该小鼠可能可以作为研究LUFS的发病机制和治疗方法的动物模型。