以CRISPR/Cas9系统制备基因敲除猪

Genetically modified pigs have been used widely in agricultural and biomedical research. Gene targeting is an important technology for generation of transgenic pigs. In the large livestock animals, gene targeting can be achieved only via the homologous recombination in somatic cells, which is inefficient, because their germline-competent pluripotent stem cell lines have not been established. The ZFN and TALEN technologies have been used to improve the efficiency. However, the off-target effects or some other unknown cytotoxicity are big concerns for both ZFN and TALEN systems. The CRISPR/Cas system is a new gene-targeting technology based the binding of RNA to the target DNA. The evidences from the mammalian cell experiments have showed that it can become a potential gene editing technology with a higher efficiency. We plan to explore the feasibility of production of gene-targeted pigs via CRISPR/Cas system. The success of this project is expected to be a major technology breakthrough, which will promote the studies on production of genetically modified large animals.

基因修饰猪在生物医药和农业领域都有重要应用价值。基因打靶是制作各种基因修饰动物的重要技术手段。由于猪的能够参与生殖系嵌合体的多能干细胞一直未能建立，基因打靶只能通在体细胞同源重组来实现，但其效率极其低下，这一难题由于近来锌指核酸酶（ZFN）和类转录因子效应物核酸酶（TALEN）技术的应用而得以缓解，但这两种技术都存在脱靶效应或其它未知的细胞毒性等问题。今年新出现的CRISPR/Cas系统是一种基于RNA的打靶系统，在细胞水平已证实其可能成为一种比ZFN和TALEN更高效、更广谱和更简易的基因打靶动物制作技术，但目前，上述技术路线在动物中还没有被打通。申请者拟将对CRISPR/Cas系统用于基因打靶猪培育的相关关键技术环节加以探讨，建立一套适合于猪高效基因打靶技术体系。该目标的实现，是基因修饰大动物制备上的重大技术突破；该成果的运用，将大力促进我国培育含有优良性状并具有重要医用价值的猪模型。

猪作为优良的大动物模型已在生物医学领域得到了广泛应用。对猪基因组进行精确修饰，是制作各种猪模型的关键技术之一。然而截至本项目申请之时，猪的基因修饰操作还是较为困难的。近年来，一些新型基因编辑工具的出现，如ZFN、TALEN等，已在猪的基因修饰上取得了一定进展，但仍存在效率低、适应性不广等问题。CRISPR/Cas9基因编辑工具以其高打靶效率、构建简单等优势，在一出现就得到了广泛应用，大大促进了大动物基因修饰研究领域的发展。本项目在国内率先尝试将CRISPR/Cas9基因编辑技术应用于基因修饰猪的制作上，建立了稳定高效的基于CRISPR/Cas9技术的基因敲除猪制作平台。. 我们针对猪的PARK2、 PINK1和TYR基因的外显子区域分别设计了基于CRISPR/Cas9系统的gRNA。其中PARK2和PINK1双基因同时敲除是用以建立帕金森症的疾病模型猪，TYR的基因敲除建立白化病的疾病模型猪。将相应基因的gRNA和Cas9共转染猪胎儿成纤维细胞后，筛选获得纯合的PARK2/PINK1双基因敲除细胞系和TYR双等位基因敲除细胞系。PINK1双等位基因敲除的效率达65.1%，PARK2双等位基因敲除的效率达63.5%，PARK2/PINK1双基因同时敲除的概率为38.1%；TYR双等位基因敲除的效率为20.7%。以PARK2-/-/PINK1-/-细胞系进行核移植共制作了1729枚重构胚，植入10头代孕母猪，其中有4头怀孕到期并产下20头克隆猪。经测序鉴定20头猪全部为PARK2-/-/PINK1-/-双基因敲除克隆猪。免疫荧光显示PARK2-/-/PINK1-/-猪的大脑组织中缺失PINK1和Parkin蛋白的表达。对于TYR-/-细胞系，共构建了1705枚重构胚，植入7只受体母猪体内，其中有4只怀孕并到期生产18只克隆猪，其中15只为TYR敲除克隆猪。TYR敲除克隆猪全部为白色。组织学分析显示TYR-/-克隆猪的皮肤、眼睛和毛发都缺乏黑色素，展示了明显的白化症疾病表型。. 本项目建立的基于CRISPR/Cas9系统的基因敲除猪制作平台可以高效、稳定、快速地建立基因敲除猪，并且可以一次性敲除多个基因。本研究建立的CRISPR/Cas9技术手段也被广泛应用于其它基因修饰大动物模型的制备中，大大推动了基因修饰大动物在生物医学和农业生产等领域的应用。