磷酸二酯骨架修饰的光敏感siRNA的合成及其对基因表达的光调控

Spatiotemporal regulation of gene expression is very important to gene fuction research and new gene therapy. We will synthesize four corresponding photoresponsive phosphoramidites from appropriate protected nucleosides and 1- (2- nitrobenzyl) ethanol phosphoramidite for RNA solid phase synthesis. The phosphoramidites are inserted to a particular location of sense strands and antisense strands of siRNA sequences by DNA solid-phase synthesizer. The photoresponsive modification at various positions on the phosphate backbones of siRNAs is done to investigate their stability, conformation and the ability to both knockdown endogenous and exogenous gene expression in cells and restore the normal level of activity upon irradiation. We hope to find key residues on the siRNAs with photolabile modification which maximizes the photomodulation of target gene expression. The ability will show promising application in spatiotemporal regualtion of specific gene function and disease genes.

在时间和空间上调控特定基因的表达对基因功能的研究和新疗法的探索有着重要的意义。本项目拟合成四种光敏感的核苷亚磷酰胺单体和1-（2-硝基苯）乙醇的亚磷酰胺单体，通过DNA固相合成仪将其插入到siRNA单链序列的特定位置，分别合成在不同位点的磷酸二酯骨架单光敏基团修饰的siRNA的正义和反义链RNA，研究光敏基团修饰后的siRNA的稳定性和构象，以及在细胞水平上对外源和内源基因表达沉默活性的抑制以及光激活后siRNA基因沉默活性的恢复。找出影响光敏感siRNA沉默活性的若干关键修饰位点，使其既能够完全阻碍基因表达而光照释放光敏感基团后又能够使得siRNA的活性充分恢复，为研究特定基因的功能和致病基因在时空上选择性调控奠定基础。

RNAi基因沉默活性的光调控对基因功能的调控和新基因疗法具有非常重要的作用。我们合成了四种磷酸酯光活性修饰的核苷亚磷酰胺单体和1-（2-硝基苯）乙醇的亚磷酰胺单体，并通过DNA/RNA固相合成仪将其定点地引入到siRNA确定位置中。对siRNA双链的每一个磷酸酯骨架进行光活性修饰，并考察每个位置光活性修饰对萤火虫荧光素酶活性的光调控，从而评价修饰位置对细胞内siRNA活性的抑制和光恢复的影响。确定了几个关键的修饰位置，并进一步将几个光活性基团同时引入siRNA双链中从而扩大其对靶向基因的光调控。此外，单个中间磷酸酯光活性修饰的RNA与互补链配对时光活性基团的水解增加且不依赖Mg2+的浓度。然而末端磷酸酯光活性修饰的siRNA双链和磷酸酯光活性修饰的单链RNA都具有相对高的稳定性，通过计算机模拟进一步解释了前者双链siRNA上光活性基团迅速水解是由于双链形成时光活性基团暴露出来便于水进攻，而后者修饰双链和修饰单链上的光活性基团和相邻的碱基形成π-π堆积相互作用，抑制了光活性基团的水解。这部分研究对于深入理解光活性修饰的siRNA调控基因表达以及磷酸酯修饰在核酸药物上的应用具有重要的意义。