BNIP3在食管鳞癌中的表达及其作用研究

食管癌是我国常见的恶性肿瘤，但其发生、发展的分子机制目前尚不清楚。BNIP3，即Bcl-2/腺病毒 E1B 19 kDa相关蛋白3，属于乏氧诱导的促凋亡蛋白，同时与细胞的自噬也密切相关。目前研究发现，BNIP3在不同的环境、不同的肿瘤细胞和肿瘤发展的不同阶段，其表达和功能存在很大差异。我们应用甲基化特异性PCR技术（MSP）检测了72例食管鳞癌标本BNIP3基因启动子，其中48例发生甲基化，而20例正常食管粘膜中无一例甲基化。因此，本课题主要采用表观遗传学手段及分子生物学实验方法，研究BNIP3表达的表观遗传学改变与食管鳞癌发生的关系，探讨其在食管鳞癌发生中的作用；进一步研究BNIP3的表达与食管鳞癌临床病理之间的关系以及对食管鳞癌细胞自噬和凋亡的影响，探讨其在食管鳞癌中的作用。目的是初步明确BNIP3在食管鳞癌中的表达及其功能，为食管癌的预防和治疗提供新的思路。

目的：研究BNIP3在食管鳞癌中的表达、其表达的表观遗传学调节机制及其在食管鳞癌细胞生存中的作用。方法：免疫组化及甲基化特异性PCR法测定BNIP3及HIF-1α蛋白在食管鳞癌组织中的表达情况及BNIP3甲基化状态，并分析其与临床病理之间的关系。RT-PCR、WB和MSP法分别检测食管癌细胞系中BNIP3mRNA和蛋白表达水平及BNIP3启动子区甲基化状态。FQ-PCR、WB及RNA干扰技术检测缺氧情况下HIF-1α与BNIP3的关系。使用胎盘蓝染色及MTT法检测乏氧及沉默BNIP3后细胞死亡及增殖情况。通过MDC染色及GFP-LC3质粒转染、Caspase 3活性检测及Annexin V-FITC凋亡检测细胞BNIP3诱导自噬与凋亡及两者的相关关系。结果：食管鳞癌组织中BNIP3蛋白表达阳性率明显低于正常黏膜组织。BNIP3低表达与食管鳞癌的浸润深度、TNM分期、淋巴结转移呈正相关，BNIP3的表达与HIF-α的表达呈负相关。食管鳞癌组织中BNIP3基因甲基化率明显高于正常组织，且与食管鳞癌的TNM分期和有无淋巴结转移相关。BNIP3在TE-7和Kyse-140细胞中低表达，在这两种细胞中BNIP3启动子区发生了明显甲基化，经5-aza-dc处理后，其甲基化状态发生逆转。缺氧时，低甲基化Caes-17中BNIP3 mRNA和蛋白的表达水平较常氧时显著升高，siRNA转染Caes-17后能显著下调HIF-1α的表达，并导致BNIP3的表达受到明显的抑制。乏氧诱导BNIP3表达上调后，可增加细胞自噬小体的生成及细胞凋亡的产生。干扰BNIP3后，两者均降低。但caspase-3活性并不随BNIP3的表达变化而变化。BNIP3表达升高后，可增加细胞死亡率。使用自噬抑制剂3-MA抑制自噬发生后可进一步提高细胞死亡。结论：BNIP3在食管鳞癌中低表达，且其基因启动子存在高甲基化；BNIP3低表达与食管鳞癌的侵犯深度、分期、淋巴结转移情况相关；BNIP3启动子区甲基化是导致其在食管癌细胞中表达较弱或缺失的重要原因之一，甲基化酶抑制剂可逆转BNIP3的甲基化状态，重新恢复其表达；缺氧能使HIF-1α蛋白的表达升高同时上调BNIP3的表达水平；BNIP3在诱导保护性自噬及凋亡中发挥重要作用，且以凋亡作用为主，但不依赖CASPASE-3途径。