食管鳞癌中藻蓝蛋白受体的分离和鉴定及其在食管鳞癌中的功能

Phycocyanin (PC) is a kind of marine bioactive substances extracted from the marine cyanobacteria, and is currently a hot topic in marine medicine development. Our preliminary results demonstrated that PC significantly inhibited the proliferation of esophageal squamous cell carcinoma (ESCC) in vitro, but its functional mechanism remains to be elucidated. In the present study, GST-PC/αchain/β chain fusion protein prokaryotic expression vectors will be constructed, respectively, meanwhile, cell membrane proteins will be isolated from a panel of ESCC cell lines, subsequently, GST-pull down method will be utilized to detect specific PC receptor proteins in different ESCC cell lines, and PC related receptor proteins will be analyzed and identified by protein sequencing technology and bioinformatics tools. Further, a series of different PC receptor proteins fragments were prepared by PCR method, and recombinant expression vectors with different PC receptor fragments will be constructed, interaction sites of PC receptor and PC will be investigated. Finally, the roles of PC receptors in ESCC will be clarified in vitro and in vivo,and the molecular mechanisms will be explored, which will establish the interactions of PC and PC receptors mediated signaling transduction pathway in ESCC. The study will ultimately provide a theoretical basis for elucidation of the molecular mechanism of anti-tumor effect of phycocyanin and discovery of new tumor molecular targets.

藻蓝蛋白(phycocyanin，PC)是从海水蓝藻中提取的海洋生物活性物质，是当今海洋医药发展中研究的前沿和热点，我们前期研究结果证明藻蓝蛋白具有从体外抑制食管鳞癌细胞增殖的能力，但其确切的分子作用机制尚不清楚。本研究分别构建GST-PC/α链/β链的融合蛋白原核表达载体，同时提取不同食管鳞癌细胞株的细胞膜蛋白，采用GST-pull down研究食管鳞癌中特异性的PC受体蛋白，利用蛋白质测序技术和生物信息学手段对分离的PC受体蛋白进行分析和鉴定。进一步利用PCR分段缺失所鉴定的PC受体蛋白，构建不同区段的表达载体，研究其与PC相互作用的位点。最后从体内外不同层面阐明PC受体蛋白在食管鳞癌发生、发展中的作用，并探讨其可能的分子作用机制，从而建立食管鳞癌中PC和PC受体相互作用所介导的信号转导途径。该课题最终为阐明藻蓝蛋白抗肿瘤作用的分子机制以及发现新的肿瘤分子靶点提供理论依据。

越来越多的研究表明，藻蓝蛋白具有很好的抗肿瘤效果，但其在食管鳞癌中的作用尚不清楚。在本研究中，我们分别克隆了藻蓝蛋白全长基因，α亚基和β亚基基因，并通过测序分析证实α亚基和β亚基基因序列的正确性。进一步我们构建了α亚基和β亚基的真核表达载体pcDNA3.1-alpha和pcDNA3.1-beta以及原核表达载体pET28a-alpha、pET28a-beta、pET32a-alpha和pET32a-beta。蛋白表达结果表明，pET28a-alpha和pET32a-alpha均见诱导表达条带，但pET28a-alpha诱导效果最佳，此外，pET28a-beta和pET32a-beta也均见诱导表达条带，而pET32a-beta诱导效果最为理想。最后我们通过大量纯化α和β蛋白，其中一部分用来制备α和β蛋白的抗体，另一部分采用MTS检测其对食管鳞癌细胞增殖的影响，结果显示在12µg的α蛋白能显著抑制食管鳞癌EC1、Eca109和EC9706细胞的增殖，表明其潜在的抗食管鳞癌增殖的活性。未来我们尚需研究β蛋白在抗食管鳞癌增殖中的作用，并从分子水平上解析α和β亚基蛋白在抗食管鳞癌增殖中的分子调控机制，以期为食管鳞癌的分子靶向治疗提供理论依据和新的发展方向。