结核分枝杆菌DnaA乙酰化修饰与DNA复制调控的研究

结核杆菌感染宿主后，大多以潜伏感染的形式存在于宿主体内，此时DNA复制变缓或停止，但其调控机制还不清楚。我们利用蛋白质组学技术发现细菌中存在广泛的蛋白质乙酰化修饰现象，并调节蛋白质的各种功能。DnaA是DNA复制起始过程中的关键蛋白，前期实验表明结核杆菌DnaA的ATP结合域（Walker A motif）的赖氨酸残基存在乙酰化修饰现象。该结合域的赖氨酸残基的ε-NH2与底物ATP在空间上非常接近。因此我们提出假说：在结核杆菌中DnaA的ATP结合域通过赖氨酸残基的乙酰化修饰改变DnaA活力，并精细调节结核杆菌DNA复制。本课题将拟综合采用体外和体内细胞模型的研究策略，探讨结核杆菌DnaA的乙酰化修饰与DNA复制的内在关系，深入研究结核杆菌DNA复制起始调控的机制，充分理解结核杆菌潜伏感染过程中DNA复制的调控，为结核患者的临床治疗以及新型抗结核药物的开发提供理论基础和实验依据。

通过三年的努力，我们按照原计划，对细菌复制起始蛋白DnaA的乙酰化及功能进行了详细的研究，同时拓展了结核杆菌部分的工作，研究了结核病人血清的代谢组学变化，为结核病的诊断开拓了新的思路。.我们通过研究发现，DnaA可以在体外被乙酰化酶Pat及去乙酰化酶CobB修饰。检测生理状态下纯化出的DnaA乙酰化程度，发现从迟缓期到平台期，DnaA乙酰化程度升高，且与WT相比，∆cobB菌株DnaA乙酰化程度升高，∆pat菌株乙酰化程度下降。表明生理状态下CobB/Pat调控DnaA乙酰化修饰。流式细胞检测表明，与WT相比，∆cobB菌株复制起始减弱，∆pat菌株复制起始增强。这表明CobB/Pat可能通过影响DnaA乙酰化程度来影响DNA复制起始。.通过LC/ESI/MS质谱鉴定，DnaA的23个赖氨酸位点中被鉴定出有16位点被乙酰化修饰，其中有比较保守的Walker A上的K178位。对该位点进行定点乙酰化修饰后检测其功能，发现DnaA(K178Ac)对ATP/ADP结合能力下降，ATPase活性也受到影响，对复制起始位点结合能力亦减弱。除此之外，我们还发现CobB/Pat对dnaA promoter的自调控也有影响。至此，我们认为DnaA的乙酰化修饰对DNA复制起始有负调控作用，其中K178位点发挥关键作用，且乙酰化酶Pat及去乙酰化酶CobB也参与了这一调控。.另外，采用核磁共振与多元数据分析技术相结合的方法，对结核病人及健康对照组血清样本进行了研究。结果发现结核病人血清中某些小分子代谢产物的浓度发生了较大变化，在结核病人血清中浓度升高的有： 1-甲基组氨酸、乙酰乙酸盐、丙酮、谷氨酸盐、谷氨酰胺、异亮氨酸、丙酮酸、酪氨酸；浓度降低的有：丙氨酸、甲酸盐、甘氨酸、丙三基胆碱磷酸和低密度脂蛋白。进一步对差异代谢产物进行代谢通路富集分析发现与健康对照组相比较，结核病人机体内的蛋白质合成通路、苯丙氨酸-酪氨酸代谢通路、氨循环、丙氨酸代谢、尿素循环、酮体代谢、葡萄糖-丙氨酸循环通路等代谢通路发生了变化。综上所述，结核病人血清具有特征的性代谢图谱，该结果能够为结核病的发病机制、病情发展变化及治疗情况的评估提供重要的依据。