结核分枝杆菌的DNA复制调控网络及其与耐药性突变偶联的遗传机制研究

耐药型结核全球蔓延，形势严峻，对人畜健康和公共卫生安全构成了严重威胁。结核分枝杆菌具有独特的DNA 复制调控系统且能直接影响基因组的稳定性，但有关的信号途径及其与耐药性基因突变偶联的分子机制目前尚不清楚。针对这一科学问题本项目拟以病原基因组学研究的成果为基础，将整体的网络构建与局部的蛋白质功能分析相结合，首先整合细菌双/单杂交技术在全基因组范围建立病原菌DNA 复制调控信号网络，然后采用EMSA、Pull-down、SPR 以及基因敲除或超量表达等技术对关键蛋白质的复制调控功能及其与耐药性突变之间的偶联特性进行剖析，从而深刻揭示结核分枝杆菌DNA复制蛋白质分子机器的部件构成、相互作用、表达调控及其与耐药性基因突变之间的内在联系。本项目的成果将大大提高我们对结核菌独特DNA复制调控及耐药突变机理的深入理解，促进抗结核新药的研发，具有重大的理论价值和深刻的现实意义。

本项目中期评估考核结论为A，目前已经圆满完成了拟定的研究目标，取得了一系列重要成果。通过四年的努力，本项目建立和完善了微生物蛋白质相互作用网络研究技术体系，在国际上率先用实验方法构建了结核分枝杆菌的全局性蛋白质相互作用网络，发现了3个具有结核病诊断应用前景的新抗原(J Proteome Res,2010a; J Proteome Res,2010b; Methods Mol Biol, 2012)。成功鉴定了重要DNA复制修复相关蛋白（如TopA, DnaA, DnaB, SSB, RadA, DisA, AAG, ParA和Lsr2等）通过相互作用调控分枝杆菌细胞生长的新机制(Nucleic Acids Res, 2010;J Biol Chem, 2013a; PLoS ONE, 2012)。发现了MtrA, ClpR和Ms6564等转录因子广泛调控分枝杆菌DNA复制和损伤修复基因的表达，显著影响细菌的基因突变频率和对主要抗结核药物的敏感性(Nucleic Acids Res, 2012; J Biol Chem,2011)。解析了广泛调控子Ms6564与靶DNA复合物的晶体结构，揭示了DNA-蛋白质相互作用的分子基础 (J Biol Chem, 2013b)。发现了一个GntR家族的调控子能够响应铜离子信号，广泛调控30多个ABC transporter基因的表达，严重影响分枝杆菌对抗结核药物的敏感性(J Biol Chem, 2012)。在分枝杆菌中首次鉴定了第二信使分子的调控因子受体，发现和命名了一个DarR因子能直接响应c-di-AMP信号调控靶基因的表达，显著抑制细菌脂肪酸的合成，最终影响分枝杆菌的多种生理特性(J Biol Chem, 2013c)。发现和命名了一个TetR家族的LtmA转录因子，能直接响应c-di-GMP信号调控30多个脂代谢和运输基因的表达，影响细胞的通透性，最终调控分枝杆菌对异烟肼和利福平等主要抗结核药物的敏感性(Nucleic Acids Res, 2012)。因此，本项目发现和阐明了多种DNA复制修复调控及其与结核分枝杆菌的细胞生长和耐药性偶联的分子机制，大大加深了我们对结核分枝杆菌耐药性形成机理的认识，也为进一步针对耐药型结核研发新型诊断方法和防治技术奠定了基础。项目研究成果共发表SCI论文26篇，获国家授权专利4项。