双酚A对雄性生殖能力跨代影响的表观遗传学分子机制研究

随着经济的高速发展，环境污染对人类健康的影响日益严重。双酚A（BPA）是人类日常生活中最广泛接触的工业化合物之一，具有与雌激素类似的化学结构，能干扰机体正常内分泌系统。更为严重的是，其可通过表观遗传学修饰使得对机体性状的改变可在子代中稳定遗传，然而目前对其分子机制知之甚少。因此，本课题拟利用金黄仓鼠作为动物模型，观察F0代孕鼠BPA暴露后对F1至F4代雄鼠生殖能力的跨代影响。然后通过比较BPA暴露后F3代各实验组雄鼠的基因表达及甲基化图谱的差异，系统分析雄性生殖信号通路上相关基因的表达与甲基化修饰的变化及其分子机制。在此基础上，利用QMSP等技术对DNA甲基化酶、印记基因、生殖凋亡基因、核激素相关受体及抑制剂等基因的表达和甲基化进行定量分析，进一步揭示其表观遗传学分子机制，为环境激素暴露对人类健康的影响提供科学依据和理论基础。

双酚A（BPA）是人类接触最广泛的工业化合物之一。其具有与雌激素类似的结构且化学性质稳定，是典型的环境内分泌干扰物。本研究以BALBc小鼠为模型探讨BPA的围产期暴露后对子代雄鼠精子的跨代影响及BPA对小鼠睾丸支持细胞（Sertoli cells）增殖与紧密连接影响的分子机制。研究结果表明：1）围产期小鼠的BPA暴露对雄性子代生殖毒性的影响：孕鼠围产期进行5 mg/ kg/day和5 μg/ kg/day的BPA连续15天灌胃，对F1-F3代雄性小鼠进行精子CASA及存活率分析。结果表明，BPA暴露组的F1-F3代雄鼠的精子活力明显弱于对照组，且BPA暴露可引起雄性子代睾丸组织的损伤；2）BPA可通过GPR30和ERα/β活化ERK1/2促进支持睾丸支持细胞增殖：研究结果表明1～10 nM BPA能够显著促进TM4细胞增殖，并增加细胞S期比例。G15（GPR30抑制剂）和ICI 182780（ERα/β抑制剂）能够逆转BPA诱导的细胞增殖及ERK1/2的快速活化。抑制GPR30/EGFR信号，能逆转BPA诱导的ERK1/2的活化和细胞增殖效应，表明GPR30/EGFR/ERK1/2参与了BPA的促增殖相应。同时BPA能剂量依赖性上调GPR30蛋白及mRNA的表达；3）利用蛋白组学解析BPA对睾丸支持细胞增殖双向效应的分子机制：为了阐明高低剂量BPA对细胞增殖相反效应的分子机制，我们采用蛋白质组学比较了10-8 M和10-5 M BPA处理TM4细胞24 h后的蛋白变化，发现36个蛋白的表达变化具有统计学差异，其主要与能量代谢及氧化应激相关。进一步研究表明10-5 M BPA提升细胞的氧化应激水平，而ROS清除剂NAC能有效的逆转BPA诱导的抑增殖效应。而Oligomycin A（ATP抑制剂）能逆转10-8M BPA的促增殖效应；4）利用基因芯片分析BPA影响睾丸支持细胞TM4细胞间的紧密连接：采用Mouse Tight Junctions PCR Array检测紧密连接关键基因的mRNA变化。结果表明BPA能引起Cldn4、Ocln等的明显下调以及Cldn2等的显著上调。同时，Western blot提示Ocln的变化可能与ERK1/2活化存在关联。我们研究表明，BPA能干扰小鼠睾丸支持细胞的正常增殖与紧密连接功能，并能造成小鼠的子代精子活性的显著降低。