雌激素受体（ERs、GPER）介导双酚A对雄性生殖细胞钙稳态的影响及毒性机制研究

环境雌激素- - 双酚A(BPA)化学结构与雌激素类似，动物实验已经证实其具有雌激素样活性，能竞争性结合雌激素受体（Estrogen receptor,ER），产生相应的毒性效应，许多研究已证实，BPA具有明显的雄性生殖系统毒性作用，但作用机制尚不完全清楚。雌激素受体包括ERα、ERβ和G蛋白偶联雌激素受体（GPER），并通过基因组和非基因组作用机制发挥作用。我们的试验研究发现BPA影响雄性生殖细胞胞内钙稳态，本项目在前期工作的基础上，通过观察雌激素受体介导的BPA对雄性生殖细胞钙离子通道、调控胞内钙离子浓度的受体以及相关信号通路的影响，运用雌激素受体基因敲除小鼠体内和体外试验，从基因、蛋白水平，在胞膜、胞内、胞核几个环节探讨BPA通过雌激素受体对雄性生殖细胞胞内钙稳态的影响及其作用机制，探索BPA雄性生殖毒性机制，寻找BPA的作用靶标，并为其它环境雌激素雄性生殖毒性机制提供理论依据。

环境雌激素——双酚A(BPA)化学结构与雌激素类似，动物实验证实其具有拟雌激素样活性，能竞争性结合雌激素受体（Estrogen receptor, ER），产生相应的毒性效应。既往研究显示，BPA具有明显的雄性生殖毒性作用，但作用机制尚不完全清楚。我们的研究发现，BPA可破坏生殖细胞的钙稳态，进而可能导致生殖细胞的损伤，主要表现为：1、BPA处理后，可降低野生型、α-ERKO和β-ERKO小鼠的附睾脏器系数以及精子畸形率，增加睾丸组织中Cav3、RyRs的表达，下调IP3Rs的表达水平。在α-ERKO小鼠附睾中，BPA可减少Cav3.3、RyRs、IP3R1和IP3R3的表达。在β-ERKO小鼠附睾中，BPA可降低RyR2、RyR3、IP3R1和IP3R2的表达水平，但增加RyR1的表达水平。在野生型小鼠附睾中，BPA使Cav3.3、IP3R1和IP3R2表达水平降低，Cav3.1、Cav3.2和RyRs水平升高。2、BPA对小鼠生精细胞T型Ca2+电流具有抑制作用，呈浓度依赖性，并使T型钙通道的激活曲线和失活曲线均向超极化方向移动，斜率因子增大。3、不同浓度的BPA可增加胞内钙的荧光强度，呈剂量依赖性。4、BPA可引起睾丸支持细胞TM4细胞活力下降，上调ERβ和钙调蛋白（CaM）的表达，激活CaMKII，促进细胞色素C从线粒体向胞浆的释放，增加BAX的表达，下调Bcl-2浓度，水解激活Caspase-3。而用CaM抑制剂W7， CaMKII抑制剂KN62与细胞共孵后，BPA引起凋亡蛋白Cleaved Caspase-3的表达明显降低。类似的结果在BPA作用小鼠精母细胞系GC-2的过程中亦得到验证。我们研究表明，BPA可能作用于雌激素受体，且对α-ERKO小鼠的生殖损伤更明显。另外，BPA可影响钙稳态和相应的Ca2 +信号通路CaM-CaMKII，引起细胞损伤。我们通过观察雌激素受体介导的BPA对雄性生殖细胞钙离子通道及相关信号通路的影响，探索BPA雄性生殖毒性机制，寻找BPA的作用靶标，并为其它环境雌激素雄性生殖毒性机制提供理论依据。