自噬与凋亡在PBDE-47神经毒性中的作用研究

2,2',4,4'-Tetrabromodiphenyl ether (PBDE-47), a new persistent organic pollutant, has raised worldwide concern for its developmental toxicity on central nervous system and adverse effects on children's intelligence. But the exact mechanisms underlying the neurotoxicity of PBDE-47 remain unclear. Previous studies in my lab show that apoptosis, the process of programmed cell death, is one of the key factors in PBDE-47 induced neurotoxicity. However, other mechanisms of pathogenesis also exist and participate in neurotoxocity induced by PBDE-47. It has not been reported whether autophagy, a catabolic process involving the degradation of cellular components through the lysosomal machinery, is involved in PBDE-47 induced neurotoxicity and associated with apoptosis. Using in vitro cell culture，animal toxic exposure study, and human epidemiological study, this research project will be focused on effects of PBDE-47 at different time points of different doses on learning and memory in rats, morphology of different parts of brain, glucose metabolism, mitochondrial function, oxidative stress, apoptosis and autophage. Effects of mitochondrial apoptosis and autophagic cell death pathways on neurotoxicity induced by PBDE-47 and the cross talk between the two death pathways will be investigated in depth by enhancing autophagy, inhibiting autophagy and antagonizing apoptosis. Consequently, we will be able to gain insight into the molecular mechanisms of PBDE-47 induced neurotoxicity, identify early diagnostic biomarkers and find a new way to block its neurotoxicity.

PBDE-47是一种新型POPs，对神经系统的发育毒性及其对儿童智力的影响已受到高度重视，但其神经毒性作用机制仍不清楚。我们前期研究结果提示，凋亡是PBDE-47产生神经毒性的关键因素之一，但在其导致的神经毒性中，除凋亡外还有其它机制参与。作为另一种细胞程序性死亡方式的自噬是否参与PBDE-47所致的神经毒性及其与凋亡的关系尚未见报道。本项目拟从细胞培养、动物染毒和人群调查等途径，采用PET、siRNA、质粒转染等方法，在不同时间点研究不同剂量PBDE-47对动物神经行为、脑形态、糖代谢、线粒体功能、氧化应激、凋亡和自噬的影响。通过增强、抑制自噬和拮抗凋亡通路，探讨线粒体凋亡信号通路和自噬信号通路在PBDE-47神经毒性中的作用以及凋亡和自噬两条通路之间的串话，从而进一步阐明PBDE-47神经毒性的分子机制，为寻找PBDEs神经毒性的早期效应生物学标志和阻断其神经毒作用发生发展提供新思路。

新型持久性有机污染物PBDE-47在婴幼儿体内的高负荷对人类发展的潜在影响已引起高度关注，但对其神经毒性作用的发生机制知之甚少。本项目采用先进的分子生物学技术和方法，重点围绕自噬和凋亡信号通路开展了PBDE-47神经毒性作用及其机制的研究。主要研究结果：（1）PBDE-47可在不同时点和不同剂量水平上引起PC12细胞和SH-SY5Y细胞自噬囊泡和自噬体数量增加，激活自噬上游AMPK-ULK1通路，导致自噬相关蛋白Beclin1、LC3和p62蛋白表达增强，在诱导自噬体形成的同时又抑制自噬体的降解。（2）PBDE-47增强凋亡相关蛋白Cleaved caspase-3、PARP和cytochrome c以及内质网应激（ERS）标志分子GRP78、IRE1和CHOP等表达，通过ERS偶联线粒体介导神经细胞凋亡。（3）抑制自噬体生成或降解可缓解PBDE-47所致的细胞凋亡，诱导自噬则可加剧PBDE-47引起的细胞凋亡；抗氧化和抗凋亡可缓解PBDE-47所引起的自噬体蓄积，PBDE-47诱导的凋亡与自噬之间存在相互作用。（4）PBDE-47可引起胞外Ca2+内流增加导致细胞[Ca2+]i早期且持续升高，致使ΔΨm下降及cytochrome c从线粒体转移到胞浆，激活线粒体信号通路而诱导细胞凋亡。（6）肿瘤抑制基因p53在PBDE-47染毒的SH-SY5Y细胞中被活化，但p53 mRNA转录水平的增高尚不能确定是其启动子区的去甲基化所致。（7）ERS介导的自噬和凋亡失调参与PBDE-47染毒大鼠海马组织损伤所致的学习记忆能力降低，减轻ERS可改善大鼠的学习记忆能力。（8）PBDE-47影响大鼠甲状腺和卵巢组织ERS、凋亡和自噬相关蛋白的表达水平，ERS通过调节凋亡和自噬过程而介导PBDE-47致甲状腺和卵巢组织的损伤。（9）高氟诱导SH-SY5Y细胞损伤的机制可能是通过胞内钙库的释放提高[Ca2+]i水平，从而促使ROS的产生，二者共同对细胞产生毒性作用。(10)高氟诱导的发育大鼠神经毒性与低葡萄糖代谢水平以及神经退行性变化之间存在关联，对睾丸组织的损伤与睾丸组织产生ERS及炎症反应有关。（11）高氟地区儿童血浆蛋白表达谱发生了改变，长期摄入过量氟对儿童智力的影响与COMT基因多态性存在关联。以上研究结果为进一步阐明PBDE-47和氟化物的神经毒性作用机制提供了有价值的线索。