超嗜热古菌Sulfolobus islandicus非典型蛋白激酶家族Rio的功能研究

The apytical protein kinase family RIOs is widely distributed in the three domains of life. Eukaryotic RIOs are involved in ribosome biogenesis. Recently, it was shown that RIOs may also play roles in DNA metabolism, cell cycle regulation, cellular metabolism, and development. In addition, RIOs are overexpressed in myriad tumors, suggesting that RIOs are potential biomarkers and targets for anti-cancer drugs. However, how RIOs participate various pathways and tumorigenesis in eukaryotes are still far from clear. RIOs are ancient protein kinases, indicative of conserved functions. In addition, archaeal Rios resemble those in eukaryotes. In this study, using a model crenarchaeon Sulfolobus islandicus, we will systematically characterize the effects of two Rio genes deletion on ribosome biogenesis, DNA metabolism and cell cycle regulation by the well developed genetic system of S. islandicus. The potential substrates of the Rio kinases will be identified based on the phospho-proteomics analysis. Further, enzyme activity analysis, affinity chromatography, and mass spectrometry will be employed to confirm the substrates of the Rio kinases, and to investigate the physiological functions of Rios phosphorylation on their substrates. This will reveal the roles of RIOs in other processes in addition to ribosome biogenesis, which may facilitate the understanding on the evolution of RIO protein kinases and the corresponding researches in eukaryotes.

非典型蛋白激酶RIO广泛分布于三域生物中，真核生物RIO参与核糖体生物合成。最近发现RIO还可能参与DNA代谢、细胞周期调控、细胞代谢与发育等众多过程，且在多种肿瘤细胞中过表达，暗示RIO可以作为潜在的生物标记和抗癌药物的靶标。然而，RIO如何参与众多途径及参与肿瘤发生的机制未知。RIO属于较古老的蛋白激酶，推测具有保守功能，而古菌的Rio蛋白类似于真核生物。本研究以模式嗜热泉古菌冰岛硫化叶菌为材料，利用其完备的遗传操作体系分析两个Rio激酶基因的缺失对核糖体合成、DNA代谢及细胞周期的影响；通过蛋白磷酸化组学分析，寻找可能的靶标蛋白；进一步采用酶活性分析、亲和层析及质谱等方法鉴定Rio靶标蛋白，分析其对不同蛋白底物的磷酸化的生理功能。预期将揭示Rio激酶在古菌中除核糖体合成外的其他功能，有助于了解RIO激酶功能的进化，为揭示真核生物复杂的RIO作用网络及调控机制提供借鉴。

非典型蛋白激酶RIO广泛分布于三域生物中，真核生物RIO除参与核糖体生物合成外，还可能参与DNA代谢、细胞周期调控及肿瘤发生等重要过程，但其如何参与众多途径的机制未知。RIO属于较古老的蛋白激酶，古菌的Rio蛋白类似于真核生物，推测共同具有保守功能。本研究以模式嗜热泉古菌冰岛硫化叶菌为材料，首先利用其内源性CRISPR-Cas系统对两个Rio激酶基因（rio1、rio2）进行敲除，流式分析发现它们单独缺失或者同时缺失导致G1期的峰增加，且对DNA损伤剂敏感性发生变化，暗示Rio激酶缺失会影响DNA代谢或细胞周期的进程。前期我们已经通过体外活性筛选、蛋白纯化及活性分析发现Rio1可以磷酸化HJ解离酶Hjc，并影响其HJ切割活性；进一步通过蛋白磷酸化组学分析UV处理及Rio1缺失后细胞内的磷酸化变化，发现一些可能参与DNA损伤应答的重要靶标蛋白，而Rio1的一个重要功能是参与DNA损伤后的蛋白质代谢中。对其中几个磷酸化显著变化的DNA结合蛋白的分析发现，蛋白激酶可能通过磷酸化DNA结合蛋白（或类染色质蛋白）来降低其DNA结合能力；而对磷酸化苏氨酸特异识别蛋白SisFha的研究发现，它通过与磷酸化的伴侣蛋白SisvWA1的相互作用来共同抑制多个DNA损伤应答基因的转录，DNA损伤产生后，二者互作减弱，从而解除对部分应答基因转录的抑制。野生型Rio1或Rio2无法在体内被过表达，但活性缺失点突变体却可以；通过纯化点突变体、亲和层析及质谱鉴定可能与Rio激酶互作的蛋白。结果显示两个质谱样品中都有很多核糖体亚基蛋白的组分，进一步证实它们参与古菌核糖体的从头组装，此外还鉴定到一些其他可能的互作蛋白有待进一步研究。以上研究结果表明Rio激酶在古菌中除核糖体合成外还有其他重要功能，有助于了解RIO激酶功能的进化，为揭示真核生物的相关研究及调控机制提供借鉴。