苦参碱衍生物MASM及其结合蛋白RPS5抗炎作用及其机制的研究

Our previous studies have found that matrine derive MASM exhibits potent anti-inflammation. MASM decreases inflammation cytokines, TNFα, IL-6, iNOS, thus increases anti-inflammation cytokines, IL-10, Fizz1, Ym1 by means of facilitating the phenotype shift from M1 macrophages to M2 macrophages. The underlying mechanism was that MASM specifically binds to RPS5 to promote macrophages polarization. This project validate that PRS5 binds to GSK3 via Co-immunoprecipaitation methods. Based on the previous studies, we focus on investigate whether RPS5 who is target of MASM, interact with GSK3, which is triggering to change of activity of CREB, inducing transcriptionally C/EBPβ, and finally achieving the conversion of macrophages phenotype from M1 to M2 by various methods including western blot, RT-PCR, siRNA. We have established the RPS5 macrophages conditional knockout mice. We will examine the differences between wild type and Lyz2-Cre: RPS5 flox/flox mice in mediating protection against endotoxin and CLP and clarify that RPS5 is very important in regulating of immunp-inflammation. The results well reveal whether RPS5 may function as a new candidate drug target for the treatment of endotoxemia and clarify the molecular mechanism of MASM for its anti-inflammation effects. This study will useful for the discovery of a novel target to the cure of sepsis.

本课题组前期研究发现苦参碱衍生物MASM具有显著的抗炎作用，通过调节巨噬细胞表型转化来抑制促炎因子TNFα、IL-6、iNOS的释放，对抗炎因子IL-10及Fizz1、Ym1等具有显著促进作用，这一转换作用的主要机制是MASM通过RPS5促进M1巨噬细胞向M2型转化。本项目拟通过免疫共沉淀方法确定RPS5的结合蛋白为GSK3。又通过western blot、RT-PCR及小干扰等方法确定MASM通过靶向分子RPS5，使其结合蛋白GSK3活性改变，从而影响下游转录因子CREB的活性，改变C/EBPβ的转录，实现巨噬细胞M1向M2转换，达到抗炎目的。比较野生型和巨噬细胞条件性敲除RPS5的小鼠在CLP和LPS模型中的差异，明确RPS5分子在炎症免疫反应中的重要作用。本课题揭示RPS5可能的分子机制，同时阐明MASM的分子机制，为脓毒症治疗提供新的靶点。

我们从前期的实验中发现苦参碱衍生物MASM具有显著的抗炎作用，能够有效延长脓毒症小鼠生存期，降低脓毒症小鼠血清中炎症因子TNF-α、IL-6等的表达水平，减轻脓毒症小鼠的组织损伤，以及证明MASM的结合蛋白RPS5对炎症的影响。基于该研究基础，本项目继续探讨MASM的抗炎机制，以及其结合蛋白RPS5对炎症的影响，从而阐明RPS5的抗炎作用机制。首先我们构建了巨噬细胞条件性敲除RPS5的基因敲除小鼠（Lyz2-Cre:RPS5flox/flox），发现在腹腔注射LPS（5mg/kg）12小时后，RPS5敲除的小鼠体内炎症因子较对照组有显著的增加，并加重组织的损伤。从体内实验中证实RPS5参与了体内炎症反应，可将其作为抗炎药物设计的潜在靶点。其次在体外实验中发现苦参碱衍生物MASM具有调控巨噬细胞极化表型转化的作用，通过调节RAW264.7小鼠巨噬细胞和小鼠骨髓衍生的巨噬细胞BMDM抑制M1型标志物IL-6、TNF-α、NO的释放，促进M2标志物Fizz1、Ym1、CD206的表达以及Arginase的表达，说明MASM可通过调节巨噬细胞由M1型向M2型转化来抑制炎症因子释放，从而达到调剂炎症的作用。随后，我们发现MASM可通过抑制NF-κB和PI3K/AKT信号通路，使下游CREB及其转录因子C/EBPβ的表达增加，抑制炎症因子释放，达到调控巨噬细胞的极化反应的目的。RPS5作为MASM的结合蛋白，同样也参与了巨噬细胞的极化反应。通过从条件性敲除RPS5小鼠体内取得的骨髓衍生的巨噬细胞证实在LPS/IFN-γ刺激的条件下，RPS5的下调使炎症因子表达进一步增加。药物MASM则因RPS5的下调，其抗炎作用被阻断。说明RPS5的下调部分削弱了MASM的作用，并使巨噬细胞向M1型转化，提示RPS5对巨噬细胞的极化及炎症因子的表达都具有重要影响，并且证明MASM通过RPS5起到抗炎作用。从体内体外实验中首次证明RPS5在抗炎免疫中的作用和可能的分子机制，为RPS5作为抗炎治疗的靶点提供了依据，同时，明确MASM的分子机制，为其作为抗炎药物的研究提供了理论意义。这不仅是药物研究的创新，同时也是发现新的药物靶点的创新，具有重要的理论意义和应用前景。