硫辛酸调控GSH再生机制及其在预防环境污染物毒理学损伤中的作用

大多数环境污染物对机体的损伤遵循先积累氧化损伤，再启动更深层毒理学损伤的规律。有效提升机体抗氧化能力，及时阻止氧化损伤的积累，是预防环境污染物对机体深层毒理学损伤的关键。应运而生的"网络抗氧化"新理论作为预防工作的指导，提出了抗氧化功能主要由Vc、Ve、CoQ10、GSH和LA（α-硫辛酸）协调完成，其中LA为调控因子，可根据机体的生物学需要，实时再生其它抗氧化剂。本项研究针该理论中LA调控网络抗氧化剂再生机制不清晰的核心难题，拟在离体细胞和活体大鼠两个层面开展：①LA调控GSH的再生机制；②LA对网络抗氧化剂活性的调控作用；③LA核心抗氧化剂组方在预防环境污染物毒理学损伤中作用的研究，旨在用系统的毒理学试验阐明LA调控GSH的再生机制及其在抗氧化防御系统中的核心作用，并应用于指导环境污染物毒理学损伤的预防工作，纠正当前抗氧化剂（或抗氧化性维生素）滥用的混乱局面。

硫辛酸是一种性能优异的抗氧化剂，但由于其作用机制、特别是其再生其它抗氧化剂的机制不甚清晰，被当做一种普通抗氧化剂使用，其价值与应用背离。本研究旨在揭示硫辛酸再生GSH的作用及其机制，并应用于预防环境重金属污染物镉的氧化损伤，为充分发挥硫辛酸潜在价值奠定科学基础。本试验采用HepG2和L02细胞体系，对10μM, 50μM, and 100 μM硫辛酸与25μM氯化镉的单独和联合剂量分组，采用细胞与硫辛酸预先处理8小时，然后再与氯化镉共同处理16小时的染毒方式。实验结果显示：硫辛酸可以降低镉致细胞的氧化损伤，提升细胞存活率（p<0.05），降低ROS、MDA水平和DNA损伤（p<0.05）。10-100μM硫辛酸预处理的细胞能够有效增加GSH含量，恢复镉致GSH/GSSG降低的比例，高剂量硫辛酸组可以恢复到正常细胞组的比例（P < 0.01）。进一步GSH再生机制研究发现，硫辛酸上调GCLC（分别升高1.85倍-2.7倍，P < 0.01）和GCLM蛋白表达量（分别升高1.24倍-1.38倍，P < 0.01）及GCLC（提升1.89倍，P < 0.01） 和GCLM（提升3.1倍，P < 0.01） mRNA水平，提升γ-GCL活性（提升1.27-2.98倍，P < 0.01），同时通过上调GR的蛋白表达量（P < 0.01）及其mRNA表达水平（P < 0.01），提升GR酶活力（P < 0.05），提示GSH合成和还原两个路径都可以再生GSH。Nrf2/ARE通路研究结果显示，硫辛酸能够有效增加p-Nrf2蛋白表达量（P < 0.01）以及p-Nrf2/Nrf2比值（P < 0.01），增加Nrf2向细胞核迁移，有利于细胞核内Nrf2/ARE调控功能的启动；添加Keap/Nrf2通路阻断剂Brusatol的实验结果显示，Brusatol具有明确抑制Nrf2作用（P < 0.01），降低GSH再生，提示Nrf2/ARE可能是调控下游抗氧化酶γ-GCL和GR酶活性的有效通路。硫辛酸再生GSH的功能可以根据机体抗氧化需要实时发挥作用，有别与外源性补充抗氧化剂容易出现过量的弊端，具有较好实用价值。