PTEN信号途径在周围神经损伤再生中的作用及其相关调控机制的研究

In recent years, some studies found that PTEN signaling pathway involved in promoting the regeneration of the optic nerve injury, but whether this signaling pathway involves in the regeneration after peripheral nerve injury is not yet clear. Our preliminary experiment showed that the dorsal root ganglion (DRG) had axonal growth and Schwann cells (SCs) could proliferate greatly by inhibiting PTEN in vitro. Based on these results, in order to further study PTEN signaling pathway in peripheral nerve regeneration and its associated regulatory mechanism, we will set up the sciatic nerve injury model in rats firstly, and observe PTEN expression and its possible downstream pathway - AKT/mTOR signaling molecule expression and functional changes. In addition, the axonal growth, apoptosis of DRG and the impact of SCs morphology and functional expression will be investigated. By inhibiting the different nodes in these signal pathways, the influence of the nerve regeneration and the DRG or SCs’ morphology will be investigated. Then we will propose and confirm that miR-21 will affect nerve regeneration through targeting PTEN gene. The project aims to further reveal PTEN-AKT/mTOR signaling pathway participates in pathophysiological process of peripheral nerve regeneration after injury, put forward and confirmed that miR-21 can inhibit PTEN expression level by targeting PTEN gene, and then activate PTEN-AKT/mTOR signaling pathway.

近年来研究发现PTEN信号途径参与促进视神经损伤后轴突的再生修复，但其是否参与周围神经损伤后再生过程则尚未明确。在我们前期预实验发现抑制PTEN可起到促进背根神经节（DRG）神经元轴突生长和促进施旺细胞（SCs）增殖的基础上，深入研究PTEN信号途径在周围神经再生中的作用和相关调控机制。拟在大鼠坐骨神经损伤模型上，观察PTEN及其可能下游关键信号分子AKT/mTOR的表达和功能变化；以及在DRG轴突突起、凋亡和SCs形态和功能表达的影响；观察抑制该信号途径中的不同节点后的变化；提出并验证miR-21通过与靶基因 PTEN 结合产生抑制PTEN的表达，从而调控周围神经轴突再生。该项目旨在进一步揭示PTEN-AKT/mTOR参与周围神经损伤后再生的病理生理过程，提出并证实周围神经损伤后再生后miR-21可通过靶向调节PTEN基因，激活AKT及其下游mTOR激酶活性，从而促进神经再生的新假说。

拟对周围神经发育时胞体/轴突生长与神经损伤时胞体/轴突再生这两个有共性的生物学过程的分子机制的研究中着手，探索PTEN信号途径在周围神经再生中的作用。首先通过获取周围神经发育的不同阶段的坐骨神经和及其胞体背根神经节（DRG）标本进行免疫荧光染色，结果显示PTEN在胎鼠和乳鼠DRG和坐骨神经处于低表达，但在成年后处于高表达，且以神经纤维轴突表达为主，提示PTEN参与调节周围神经发育过程且活跃表达于成熟神经轴突；接着建立大鼠坐骨神经钳夹伤模型，检测PTEN表达与坐骨神经再生过程相比较发现PTEN处于抑制表达状态，且与再生恢复情况成正相关；为进一步证实PTEN表达与神经轴突再生关系，于大鼠坐骨神经钳夹损伤后24h后开始腹腔注射PTEN抑制剂（bpV），术后结果显示抑制PTEN后可有效增强大鼠坐骨神经钳夹伤的恢复疗效；同时通过对去细胞同种异体神经负载Bvp后，可提高去细胞同种异体神经修复大鼠15mm长的坐骨神经缺损的疗效；为进一步了解PTEN调控施万细胞（SCs）生物学行为，参与促进周围神经轴突再生情况，使用PTEN特异性抑制剂 (Bpv)和PTEN siRNA拮抗PTEN的功能，结果显示抑制PTEN后可以促进SCs的分裂增殖，合成分泌NGF和GDNF以及迁移的能力，并可显著促进周围神经再生。在逐步地理解持续低表达的PTEN在周围神经损伤修复过程中的重要性后，围绕PTEN的调控网络成了下一步关心的研究方向。遂通过建立大鼠坐骨神经横断损伤模型，于损伤后0d（正常对照组）、3d、7d和14d切取神经生长锥部位进行送样，采用circRNA高通量测序，并进行circRNA鉴定，表达量计算，注释分析、分布统计以及circRNA保守性分析，互作miRNA分析等，结果显示与对照组比较，其中67个circRNA表达持续下调，76个circRNA表达持续上调。其中持续低表达的环状RNA（Transcript_id：2:4961753|5031767//ENSRNOT00000041541）与miR-21的表达呈现负相关关系，进一步预测分析也发现该环状RNA与miR-21存在序列匹配的结合位点，可能存在竞争性结合miR-21的作用，并有可能作用靶基因PTEN。这些研究有助于更全面的了解周围神经损伤和再生的分子机制，为周围神经再生修复提供可参考的理论依据和新治疗靶点。