Tnc在周围神经损伤再生中的作用及其分子机制研究

The molecular mechanisms that are responsible for the proliferation, migration, and axon growth-promoting effects of Schwann cells during peripheral nerve injury and regeneration are still unclear. Our preliminary experiments, especially the analysis data of artificial neural network, suggested that the tenascin C (Tnc), an extracellular matrix glycoprotein, played a core role in the process of nerve injury and regeneration. Based on this, the present study aims to show that Tnc, as fibroblasts- produced damage signal molecule, could promote the proliferation, migration and myelination of Schwann cells in a paracrine manner by in vivo and in vitro experiments. Our plans are (1) to detect the migration and myelination of Schwann cells by using the recombinant Tnc protein and the inhitotors of its downstream signaling pathway; (2) to construct tissue engineered nerve grafts that contained the sustained released recombinant Tnc protein, or to perform the experiment of siRNA lentiviral vector transfection into the injured animal for repair of rat sciatic nerve defect, and further to evaluate the repair ourcome of Tnc for nerve transection injuries by the aid of functional and morphological methods. It is expected that our study regarding Tnc functions has the important theoretical significance and potential clinical merits, and is likely to provide important clues for exploring Tnc complex functions and the related molecular mechanisms and developing novel tissue engineered nerve grafts.

周围神经损伤及再生过程中施万细胞的增殖迁移以及促轴突生长的相关调节机制仍不完全清楚。前期的研究结果表明细胞外基质糖蛋白 Tnc (tenascin C) 在神经损伤与再生过程起着重要调控作用。基于人工神经网络分析结果，本研究拟通过体内外实验进一步论证Tnc作为成纤维细胞产生的损伤信号分子，以旁分泌的方式促施万细胞的增殖迁移及成髓鞘。利用Tnc重组蛋白及其下游的信号通路的抑制剂检测其对施万细胞的迁移、成髓鞘的影响。构建含有Tnc重组蛋白缓释的组织工程神经移植物修复大鼠坐骨神经缺损，或通过siRNA慢病毒载体转染实验动物，分别从功能学及形态学等方面评价Tnc对神经横断伤修复的作用。Tnc的研究具有重要的理论意义和潜在的临床价值，将为探索 Tnc复杂多样功能的分子机制和新型组织工程神经的研究提供重要线索。

周围神经再生需要再生组织中各种类型细胞的精确协调和相互作用。施万细胞，作为周围神经系统的主要结构细胞，在神经损伤再生过程中它的表型调节影响神经再生的功能修复。成纤维细胞通过分泌细胞外基质与组织内其他核心细胞相互作用以维持组织的基本结构框架和产生收缩力，并在伤口愈合过程中发挥重要作用。然而，成纤维细胞和神经组织内其他细胞 (比如施万细胞) 相互作用的功能在周围神经损伤和再生的过程还没有得到足够的重视，是否成纤维细胞和施万细胞之间的相互作用影响了施万细胞的细胞表型变化这个周围神经损伤后重要的细胞过程。本研究通过表达谱芯片技术分析坐骨神经损伤后不同时间点的缺损近端神经，我们共检测到6046个差异基因 (p<0.01, FDR<0.05)，经生物信息学分析分析表明细胞外基质糖蛋白tenascin C (Tnc) 在人工神经网络中具有极高的权重，提示其作为一个关键基因在神经再生过程中起着非常重要的调节作用。体内实验结果表明神经再生过程中Tnc主要表达在成纤维细胞中而在施万细胞中并不表达；成纤维细胞和施万细胞共培养实验系统及Tnc可溶蛋白作用于施万细胞研究Tnc对施万细胞迁移的影响，结果表明Tnc可促进施万细胞的迁移而对增殖没有影响；利用siRNA抑制成纤维细胞Tnc的合成及分泌，并在此基础上以共培养系统研究其对施万细胞的影响，结果表明抑制成纤维细胞分泌Tnc可降低与之共培养的施万细胞的迁移。免疫共沉淀的方法研究证明Tnc与施万细胞表面的β1-integrin 直接结合发挥作用；利用siRNA及各种受体的抑制剂等方法研究表明Tnc通过结合施万细胞表面的β1-integrin受体激活下游Rac1信号促进施万细胞迁移。采用内含人工合成Tnc siRNA及阴性对照序列和基质胶混合物的硅胶导管或构建内含人工合成Tnc 蛋白的硅胶导管作为支架构建修复大鼠坐骨神经缺损，结果表明Tnc 在神经再生过程中促进施万细胞的迁移及神经元轴突再生。总之，本课题通过体内外实验研究证明，周围神经损伤后成纤维细胞大量分泌Tnc，以旁分泌的方式与施万细胞表面的intergin β1 受体结合影响下游信号通路，激活小G蛋白家族成员Rac1，影响再生过程中施万细胞的迁移，继而促进再生的进行。Tnc的研究具有重要的理论意义和潜在的临床价值，为探索Tnc复杂多样功能的分子机制和新型组织工程神经的研究提供线索。