胚胎干细胞来源感光细胞在变性视网膜中的整合机制及Muller细胞的影响

Retina is an ideal organ for cell transplantation in neural regeneration. The recent development of stem cell technique demonstrated that the damaged vision can be relived and restored by cell transplantation.The safety and the short term therapeutic effect of grafted stem cell in the degenerative retina has been reported in most recent clinical trials. However, it has not been clarified whether the grafted stem cell correctly differentiated into photoreceptor and formed the functional synapse with the neural circuit of the recepient,nor the influence of over-activated Müller cells in the degenerative retina .Our previous study showed that the synapse with typical structure and function was formed between the grafted embryonic stem cell-derived neurons and the neurons of the recepient in the hippocampus. And the degenerative microenviroment in the central nervous system significantly impacted the fates of transplanted and endogenous stem cells, with the mechanisms of influences on the intergration of stem cells has not been clarified.In this study, we infected the human embryonic stem cells with optogenetic ChR2 and induced into neural precusor cells before transplanted into the degenerative retina of RCS rats. Under the two-photon microscopy, combined with the electrophysiological and morphological techniques,by temporally precise noninvasive optical controling of hESC-derived photoreceptors , we explored the foramtion of possible graft-to -host connectivity and the influencs of activated Müller cells in the degenerative retina.The results will provide solide evidence of cell replacement in the central nervous systems.

视网膜是干细胞移植进行神经修复的理想器官.近来大量文献报道干细胞移植可缓解视网膜病变和重建视觉功能，临床研究也初步证实干细胞在视网膜变性疾病治疗中的安全性和短期效果，但对于干细胞能否在变性视网膜中分化为感光细胞并和受者神经元形成具有正常功能的突触联系、增生的Müller细胞对其有何影响？目前未见报道。我们前期研究发现植入海马的ES细胞来源神经元能和受者神经元形成具有典型结构和功能的突触联系，变性微环境对外源性和内源性干细胞的命运均有显著的影响，但尚不清楚其对植入干细胞分化命运和整合影响的机制和途径。本研究拟采用ChR2光基因修饰的人ES细胞植入RCS视网膜变性大鼠，双光子显微镜结合电生理和形态学技术实时精确刺激植入细胞，明确干细胞移植视网膜的整合机制及变性微环境中Müller细胞的影响及机制，研究结果可为阐明干细胞移植治疗视网膜变性疾病的细胞替代机制提供理论依据。

视网膜是干细胞移植进行神经修复的理想器官，干细胞移植治疗视网膜变性已经进入临床研究阶段。目前对于干细胞能否在变性视网膜中分化为感光细胞并和受者神经元形成具有正常功能的突触联系（整合）、变性微环境中增生的Müller 细胞对其有何影响，未见报道。本研究采用ChR2 光基因修饰和纳米荧光颗粒标记的视网膜前体细胞植入RCS 视网膜变性大鼠和RD1视网膜变性小鼠，采用形态学和功能学检测相结合，从分子、细胞、组织、整体水平研究干细胞移植变性视网膜的整合机制及变性微环境中Müller 细胞的影响机制及可行的干预措施，取得如下进展：.（1）构建了光基因ChR2修饰的小鼠胚胎干细胞株ChR2-EGFP/ESC或小鼠神经干细胞株ChR2-EGFP/NSCs，发现光基因可导致干细胞增殖能力的下降，对干细胞的分化潜能不影响。可能是470nm蓝光刺激对干细胞细胞膜去极化造成的。.（2） 原代分离的小鼠RPCs植入RD1小鼠视网膜后可分化为感光细胞并和受者视网膜中的神经元形成突触联系.采用干细胞膜标记ckit结合胚胎抗原SSEA1可从新生小鼠眼球壁中分选出c-kit+/SSEA1−的RPCs。原代分离的小鼠c-kit+/SSEA1−的RPCs在移植前使用量子点（Quantum dots，QDs）标记，观察到植入细胞分化的感光细胞能表达突触前相关蛋白Synaptophysin, 表面分布有突出后致密蛋白PSD95，提示植入细胞来源的感光细胞能和受者视网膜中原有的神经元和感光细胞形成有功能的突触联系。.（3）变性视网膜中Müller细胞过度增生形成的胶质疤痕是影响植入RPCs分化和整合的重要因素.当受到损伤因素刺激（如碘酸钠处理），放射样胶质细胞出现凋亡、增殖能力下降，其分化命运也从向神经元分化转变为向星形胶质细胞分化，证实了损伤刺激，包括变性微环境刺激是导致胶质细胞激活形成疤痕的重要原因。美金刚、肝脏X受体（Liver X Receptors, LXRs）激活剂T0901317以及联合移植嗅鞘细胞（OECs），可阻断变性视网膜中Müller 细胞的过度激活，增加植入细胞的整合和延长干细胞治疗效果。.本研究共发表标注资助的SCI论文10篇，培养博士研究生4名，硕士研究生4名，本科生1名。受邀参加国际会议1次，国内会议2次。