基于miRNA-202-3p过表达探讨中药疏木六君子汤预防Ⅰ型胃神经内分泌肿瘤复发的分子机制

Type I gastric neuroendocrine tumor is a kind of rare neoplasm with relative low malignant and high rate of recurrence. Currently, few prevention methods for its recurrence are acceptable because of high price or trauma. The applicant found in the clinical research that most patients with type 1 gastric neuroendocrine tumor had depressed liver and deficient spleen symptoms, and Shumu Liujunzi Decoction, an experienced formula with Shugan Jianpi Method, can effectively decrease its recurrence and delay median relapse time. However, the specific mechanism was not clear. Our pre-studies observed that abnormal upregulation of miRNA-202-3p existed in gastric tumor tissues but not in gastric mucosa without recurrent, which may be related with targeted genes DUSP1, ATP6V0A2, and so on. This program aims to conduct multi-site, progressive study to compared differences of miRNA-202-3P, DUSP1, ATP6V0A2 expression in patients’ gastric endoscopic biopsies between Traditional Chinese Medicine group and control group. For further exploration of molecular mechanisms how this tumor recurrence prevented by Traditional Chinese Medicine, neuroendocrine cells with miRNA-202-3p overexpression will be constructed to test its targeted genes by dual luciferase experiments, and to test miRNA expressions and gene expressions whether would be affected by serum with Traditional Chinese Medicine. This study will provide theoretical basis and experiment evidence for clinical application of Traditional Chinese Medicine to prevent type I gastric neuroendocrine tumor recurrence.

Ⅰ型胃神经内分泌肿瘤是一种罕见恶性肿瘤，其恶性程度相对较低，但复发率高，目前预防复发的方法或价格高昂，或创伤较大，患者多难以接受。我们在临床研究中发现，该病患者以肝郁脾虚为主要证型，申请人自拟疏肝健脾方药“疏木六君子汤”可有效降低该病复发率，延长中位复发时间，但其作用机制尚不明确。预实验发现，该病的肿瘤组织和无复发的胃黏膜组织相比，存在miRNA-202-3p异常上调，预测其主要靶基因可能为DUSP1、ATP6V0A2。本项目拟进行多中心前瞻性临床研究，对比中药组和对照组患者胃镜活检组织中miRNA-202-3p及其靶基因的表达差异。同时，构建miRNA-202-3p过表达的神经内分泌细胞，通过双荧光素酶实验进一步验证其靶基因，并观察中药含药血清对其miRNA表达和基因表达的影响，以揭示中药预防该病复发的分子机制。本研究将为临床使用中药预防Ⅰ型胃神经内分泌肿瘤复发提供理论基础和实验依据。

1型胃神经内分泌肿瘤（gastric neuroendocrine tumor，g-NET）是一种罕见恶性肿瘤，恶性程度相对较低，但复发率高达63.6%。临床观察发现，服用中药疏木六君子汤可降低1型g-NET复发率，延长中位复发时间，但作用机制尚不明。因此我们以临床与基础相结合的方式，实施前瞻加回顾性非随机对照的临床观察，采用微列阵芯片、生物信息学、细胞生物学和分子生物学等技术，围绕基于miRNA-202-3p过表达研究疏木六君子汤预防1型g-NET复发的分子机制。.研究结果：1.多中心临床研究显示，疏木六君子汤可以显著延长1型g-NET患者中位RFS时间（P<0.01），明显延长中位复发时间（P<0.05），显著降低复发风险和改善症状评分（P<0.01）。2.1型g-NET患者肿瘤中miRNA-202-3p表达明显高于服用中药后无复发患者（P<0.05）。3.1型g-NET患者血清中miRNA-202-3p的表达量显著高于健康人（P<0.01），miRNA-202-3p区分1型g-NET患者和对照组的95%可信区间为0.788~0.968，ROC曲线分析AUC为0.878，敏感性和特异性分别为88.9%和77.8%，初步验证其作为临床诊断标志物的可能。4.验证抑癌基因DUSP1为miRNA-202-3p的靶基因，可被其负向调控。5.转染miRNA-202-3p于高分化胃肿瘤细胞MKN28中，可明显降低MKN28细胞DUSP1表达（P<0.05），还有促进抗凋亡蛋白Bcl-2的表达和抑制促凋亡蛋白Bax的表达的趋势（P>0.05），并促进MKN28细胞增殖（P<0.05）。6.中药含药血清干预的MKN28细胞中，DUSP1和Bax表达被促进，Bcl-2表达则有抑制趋势（P>0.05），MKN28细胞增殖有被抑制趋势（P>0.05）。.结论：中药疏木六君子汤能有效降低1型g-NET复发率，延长中位复发时间，改善生活质量；1型g-NET患者肿瘤组织和血清中存在miRNA-202-3p高表达；miRNA-202-3p可以负向调控抑癌基因DUSP1表达，促进MKN28细胞增殖；疏木六君子汤可能通过miRNA-202-3p/DUSP1通路抑制肿瘤细胞增殖，达到预防1型胃神经内分泌肿瘤复发的效果，为“扶正抑瘤”理论指导下中医药在临床治疗1型g-NET提供理论和实验依据。.