以iTRAQ联合MRM技术研究鸡尾酒疗法抗肝纤维化作用的蛋白质基础及机制

我国肝纤维化的群体十分庞大，探索肝纤维化发生机制及防治手段是当前非常必要和迫切的工作。蛋白质组学技术是研究药物作用的蛋白质基础及分子机制的新途径。本研究将在前期的系列研究工作基础上，采用三羟基异黄酮、牛磺酸和表没食子儿茶素没食子酸酯三种药物联合组成鸡尾酒作用肝星状细胞HSC-T6和肝纤维化大鼠，通过定量蛋白质组学iTRAQ技术筛选和鉴定细胞、血清和肝组织中差异表达的蛋白质，经RT-PCR和West-Blot在细胞水平验证差异表达的蛋白质，进一步采用蛋白质组学的MRM技术在血清和组织学上对差异表达的蛋白质进行验证及确认，以阐明鸡尾酒疗法抗肝纤维化作用的蛋白质基础，分析其抗肝纤维化的分子机制，为肝纤维化的诊断、治疗和预后揭示新的可能系列标志物及靶点，也为进一步将鸡尾酒疗法应用于临床治疗奠定基础。

项目的背景: 我国肝纤维化的群体十分庞大，探索肝纤维化发生机制及防治手段是当前非常必要和迫切的工作。项目组曾发现 EGCG、Taurine和Genistein联合组成鸡尾酒具有抗大鼠肝纤维化的作用，对鸡尾酒治疗后肝星状细胞、肝纤维化大鼠的血清、肝组织的总蛋白表达水平改变及其抗肝纤维化机制深感兴趣。. 主要研究内容: 以肝星状细胞HSC-T6和SD大鼠为实验对象，在鸡尾酒药物作用后，采用iTRAQ标记联合质谱分析细胞、血清和肝组织中蛋白的表达差异。在细胞水平上采用RT-PCR和Western Blot技术对筛选出的关键蛋白进行验证。在大鼠血清和肝组织水平上对关键蛋白进行MRM验证及确认。. 重要结果: 在细胞、血清和肝组织中共筛选及鉴定到鸡尾酒药物作用后的差异表达蛋白198个，其中上调蛋白121个，下调蛋白77个。这些蛋白质中既有与肝纤维化发生、发展直接相关的蛋白质，也有在蛋白的相互作用中处于功能网络交叉点的蛋白，更有参与重要生物功能或代谢途径的蛋白。挑选Cts d、 Lamp1、Mst4、CDK4、Hdgf、Tpi1、Txn1、Fgb在大鼠血清、组织、细胞中表达变化一致或者处在相互作用关键节点的蛋白进行验证。结果显示，鸡尾酒药物作用HSC-T6细胞后，Cts d、CDK4、Txn1 mRNA的表达与iTRAQ检测结果一致。WB分析表明，Cts d、 CDK4、Tpi1、Lamp1、Hdgf、Fgb蛋白表达与iTRAQ检测结果一致，但是Mst4的表达变化不大。MRM定量确证发现CDK4、Tpi1、Txn1和Glud1在大鼠肝组织和血清中的表达与iTRAQ质谱分析结果一致。. 关键数据及其科学意义: 本项目筛选、鉴定、验证与确证一系列与鸡尾酒药物抗大鼠肝纤维化作用的关键蛋白，充分说明这些蛋白与肝纤维化紧密相关，在肝纤维化的逆转修复中发挥重要作用，共同组成了与鸡尾酒药物抗大鼠肝纤维化作用的蛋白质基础。也充分表明鸡尾酒药物抗大鼠肝纤维化的作用正是通过调节关键蛋白的表达变化、激活相关的代谢通路来实现。本项目的完将为EGCG、Taurine和Genistein组成的鸡尾酒药物的临床应用奠定了一定的理论基础，而获得的关键蛋白应为药物作用的靶蛋白，可能为肝纤维化的药物筛选或临床诊断的提供帮助。