EGCG、Taurine和Genistein联合抗肝纤维化作用靶蛋白的功能验证及质谱确认

The hepatic fibrosis people is very large in china. The prevention and treatment of liver fibrosis is currently very necessary and urgent work . The previous project, based on the National Natural Science Foundation (NSFC) , screened and identified five candidate target proteins by iTRAQ labeling and LC-MALDI-TOF/TOF for EGCG, Taurine and Genistein three drug combination against liver fibrosis. This project will confirm target protein candidate by functional verification and mass spectrometry validation. After Taurine, EGCG and Genistein combinate therapy of hepatic stellate cells and in rats, using QPCR and Western-blot analyses mRNA and protein expression of candidate target proteins in cells, serum , and organization. Through gene silencing and overexpression in liver cells, The candidate target proteins are verified the relationship between target protein and liver fibrogenesis. Establish MRM technology as the core of MIDAS process solutions The absolute quantification of the candidate target protein will validated MRM technology as the core of MIDAS process solutions.

我国的肝纤维化群体十分庞大，探索防治肝纤维化的有效方法是当前非常必要和迫切的工作。本课题组在上一个国家自然科学基金的研究中，筛选和鉴定到EGCG、Taurine和Genistein三者联合抗肝纤维化的5个候选靶蛋白。本项目将对这5个候选靶蛋白进行功能验证和质谱确认：首先以Taurine、EGCG和Genistein联合作用肝星状细胞和肝纤维化大鼠，采用QPCR和Western-blot技术对候选靶蛋白的mRNA和蛋白质在细胞、血清和组织中的表达进行验证；然后在肝星状细胞中，通过沉默或过表达候选靶蛋白基因进行功能验证，以验证候选靶蛋白与肝纤维发生发展的关系；而后建立以MRM为核心的质谱MIDAS技术流程方案，对候选靶蛋白在大鼠血清及肝组织中的表达进行定性确认；最后采用多通道微流控固相多肽合成芯片技术合成目标多肽，实现MRM技术对靶蛋白在大鼠血清和肝组织中的表达进行最终绝对定量确认。

项目的背景：我国的肝纤维化群体十分庞大，探索防治肝纤维化的有效方法是当前非常迫切的工作。本项目将对前期的研究中筛选和鉴定到EGCG、Taurine和Genistein三者联合抗肝纤维化的5个候选药靶蛋白进行功能验证和质谱确认。.主要研究内容：以联合用药作用肝星状细胞和肝纤维化大鼠，采用QPCR和WB技术对候选靶蛋白的mRNA和蛋白质在细胞、血清和组织中的表达进行验证；然后沉默或过表达候选靶蛋白进行功能验证，而后以MRM技术对候选靶蛋白在大鼠血清及肝组织中的表达进行定性定量确认。.重要结果：在大鼠肝组织中，联合药物组的FVII、Hdgf、Glud1 mRNA的表达明显低于模型组，CDK4和Mst4未见明显变化；在细胞水平上，联合用药组中FVII mRNA表达在用药后显著降低，其余基因无明显变化。WB分析表明，在大鼠肝组织中，联合药物组的FVII、CDK4、Hdgf蛋白表达明显低于模型组， Mst4和Glud 1未见明显变化；在HSC-T6中，联合药物组的Mst4和FVII蛋白表达显著低于模型组，Glud 1、CDK4、Hdgf未见明显变化。过表达FⅦ能降低HSC-T6对联合用药的敏感性，减轻药物对肝星状细胞的抑制。沉默MST4、Glud1和Hdgf，HSC-T6的增殖均减慢，并且沉默Glud1基因可以增强联合药物对HSC-T6增殖的抑制作用。MRM分析表明，药物组的大鼠血清或肝组织的Glud1蛋白表达明显高于模型组，Hdgf、CDK4的蛋白表达明显低于CCl4模型组，与前面的验证结果基本相似。可初步确认CDK4、Hdgf和Glud1为联合用药抗大鼠肝纤维化作用药靶蛋白。联合用药抗大鼠肝纤维化作用可能是通过调控MST4和Glud 1，进而调控ERK和STAT3信号通路的活化来实现。.关键数据及其科学意义：项目经过在细胞、组织和血清水平的验证和功能分析，初步确认CDK4、Hdgf和Glud1为联合用药抗大鼠肝纤维化作用可能药靶蛋白。联合药物抗肝纤维化作用可能是通过调控MST4和Glud 1，进而调控ERK和STAT3信号通路的活化来实现，并且联合药物可通过调控MST4影响TGF-β1表达而达到抗肝纤维化目的。本项目完成为EGCG、Taurine和Genistein联合药物的临床应用奠定了一定的理论基础，而获得的药靶蛋白可能为肝纤维化的药物筛选或临床诊断的提供帮助。