应用iTRAQ技术研究无机砷对人肝星状细胞自噬水平及肝纤维化的影响

Endemic arsenic disease is one of the most important endemic diseases in China.The liver is the central station of metabolism in vivo,the important target of arsenic damage.Liver fibrosis is the necessary stage of liver cirrhosis and cancer,Autophagy is a hot research topic,the relationship between autophagy,inorganic arsenic (iAs) and hepatic fibrosis has inseparable connection,whether the necessary evidence of the liver fibrosis caused by iAs stimulation and autophagy is still lacking.The project intends to adopt animal experiment,human liver HSC cells cultured in vitro,using iTRAQ to detect the autophagy protein including Beclin1,VMP1,LC3-II/I protein,etc.,looking for autophagy related proteins under arsenic stress,Assay the expression of Atgs (Atg4,Atg5,Atg8,etc.) after the effects on autophagy inhibitors and inducers with iAs stimulation in HSC cells.To analyze the influences of different valence of iAs on autophagy in different concentration and time,to detect the expression of alpha-SMA and liver fibrosis collagens in HSC,expect to find the relationship between the changes of autophagy and liver fibrosis with iAs stimulation,in order to understand the role and mechanisms of autophagy in liver fibrosis under iAs stress.This study will enrich the contents of the mechanisms of arsenic carcinogenesis,and provide a reliable basis for arsenic poisoning prevention and research.

地砷病是我国重要的地方病之一。肝脏是砷（iAs）代谢和损伤的靶器官之一，肝纤维化是肝硬化和癌变的必经阶段。细胞自噬是研究热点，与iAs致癌和肝纤维化均有不可分割的联系，但iAs引起的肝纤维化改变是否和自噬有关缺乏必要的证据。本项目在前期研究发现自噬的基础上，拟采用动物实验，体外人肝HSC细胞培养，应用iTRAQ技术检测自噬蛋白beclin 1，VMP1，LC3-II/I蛋白等，寻找参与砷诱导的自噬相关蛋白；并用自噬抑制剂和诱导剂分别处理经iAs诱导的HSC细胞，检测Atgs（Atg4，Atg5，Atg8等基因）的表达，分析不同价态iAs在不同浓度、不同时间对自噬水平的影响；检测iAs对HSC活化标志物α-SMA及胶原的表达，分析iAs刺激大鼠肝HSC活化后自噬变化和肝纤维化的关系，从而了解自噬在iAs致肝纤维化中的作用及机制。本研究丰富了砷致癌机制的内容，并为地砷病防治和研究提供可靠依据。

地方性砷中毒（简称地砷病）是我国重要的地方病之一，自噬与iAs致癌和肝纤维化均有不可分割的联系，iAs引起的肝纤维化是否和自噬有关缺乏必要证据。本项目采用动物实验，体外人肝HSC细胞培养，应用iTRAQ技术寻找参与砷诱导的自噬相关蛋白；自噬抑制剂和诱导剂分别处理经iAs诱导的HSC细胞，检测Atgs的表达，分析不同价态iAs在不同浓度、不同时间对自噬水平的影响及与肝纤维化的关系。实验结果发现（1）通过iTRAQ技术找到差异蛋白中Hic-5蛋白、谷胱甘肽合成酶与肝纤维化发生密切相关，MAPK通路、TGF-β通路、Wnt信号通路对肝纤维化调控有重要作用，氨基酸合成和代谢，脂肪酸合成和代谢等过程在砷致肝纤维化中发挥着重要作用。（2）对大鼠亚慢性砷染毒动物模型行B超检查结果发现不同剂量染毒组组间、不同时间点肝脏脏器系数均随染毒剂量的增加呈升高趋势，肝纤维化趋势明显。与对照组相比，24周砷暴露小鼠各剂量组间LC3、Beclin-1、α-SMA mRNA和蛋白表达水平均升高；除低剂量组外其余各组α-SMA mRNA和蛋白表达水平均升高。（3）通过RFP-GFP-LC3慢病毒稳定感染砷毒染的肝细胞，荧光显微镜观察到自噬小体；通过细胞活力检测，流式细胞术等检测结果发现：无机砷可降低LX-2细胞活力，提高凋亡率；随着无机砷剂量的增加LC3、SQSTM-1/P62、ATG4、ATG5、ATG8，BCL-2 mRNA高表达， BCL-XL mRNA低表达；LC3、SQSTM-1/P62、TMEM-49、BCL-XL，BCL-2，α-SMA蛋白表达增强，Beclin-1，mTOR蛋白表达降低。无机砷组及3-MA+无机砷组LC3、Beclin-1、SQSTM-1/P62基因及蛋白表达均上调。由此得出结论：（1）iTRAQ技术发现砷致肝纤维化涉及多种蛋白合成代谢及信号通路。（2）慢性iAs暴露可明显促进肝脏纤维化，自噬参与了砷代谢和肝纤维化。（3）iAs促进LX2细胞纤维化，可能通过 LX-2 细胞自噬水平影响砷致肝纤维化过程，iAs可诱导LX-2细胞发生细胞凋亡和自噬，凋亡和自噬之间可能存在拮抗作用。本项目较为科学系统地阐释了自噬在iAs致肝纤维化中的作用及机制，丰富了砷致癌机制的重要研究内容，并为下一步研究砷致肝细胞自噬的发生机制提供了理论基础。