轮枝菌弱毒菌株诱导向日葵黄萎病抗病性及相关抗病基因功能分析

Verticillium wilt of sunflowers caused by Verticillium dahliae Kleb. is a world-wide disease and caused serious damages in our country. No effective disease control method is available for practical application. Great attention has been paid to the research on biological control by using hypovirulent strains of a pathogen because of its safety and lower pollution to the environment. But there are few reports about hypovirulent strains of V. dahliae and their biocontrol mechanisms. Our previous study revealed that a significant difference in pathogenicity exists among the V. dahliae strains collected from different areas and hosts. Some low-virulent strains could induce host resistance against the infection by high-virulent strains, and improve sunflower yield and quality. This study will confirm the capacity of hypovirulent verticillium strains on the disease resistance induction, and further focus on the mechanisms involved in. Next-generation high-throughput DNA sequencing techniques (Illumina) and bioinformatics will be employed to dig out the defense-related sunflower genes, and the real-time qPCR will be used for studying the expression of specific genes and for function prediction. Full length cDNA of selected genes will be cloned and transfered into model plants for the function verification. This project may shed new light on the mechanisms of plant resistance triggered by hypovirulent pathogens, and provide an alternative method for the management of sunflower verticillium wilt.

向日葵黄萎病是由大丽轮枝菌引起的世界性病害，现已成为我国向日葵上分布最广危害最重的病害。利用弱毒菌株防治植物病害受到研究者的重视，其具有无毒对环境无污染等优点。本课题前期研究表明，来源不同的轮枝菌对向日葵在致病力上具有显著差异，并已证实轮枝菌弱毒菌株能增强向日葵对强毒菌株的抗性。本课题拟进一步验证轮枝菌弱毒菌株增强向日葵抗黄萎病作用，并重点研究其抗性增强的分子机制，即通过新一代高通量Illumina测序及生物信息学分析，选出抗病相关功能基因，再利用Real-Time PCR技术分析抗病相关基因的时空表达和进行功能预测，并克隆抗病相关基因全长cDNA，确定目标功能基因，再通过转基因模式植物进行功能验证。课题的完成为利用真菌弱毒菌株生产高效特异的生防制剂提供理论依据，为向日葵黄萎病的防治提供新的思路，既可以减少化学防治造成的环境污染，又减轻了因病菌变异造成不断培育向日葵抗病新品种的繁重负担。

诱导抗病作为一种通过单一或多种因子处理植物使植物产生对非生物胁迫及生物胁迫耐受的方法，可以广泛应用于各种病害的防治当中。本课题组在前期研究中，分离得到的一株弱毒菌株Vn-1，利用Vn-1菌株诱导向日葵可以提高对黄萎病的抗病性，为明确Vn-1诱导抗病的相关机制，从生理生化及分子水平进行深入研究。通过多代连续培养证明了弱毒菌株弱致病力的遗传稳定性。测定抗病过程中相关防御酶活性如：过氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）、过氧化氢酶（CAT）等，发现经弱毒菌株诱导后防御酶活性于24h-48h达到峰值，且与对照组相比，经Vn-1处理后的防御酶活性明显升高。还有试验证明，经Vn-1诱导后，可明显增厚木质部以及增加强毒菌株处理下的种子萌发率。在此基础上，通过转录组学研究，进一步探求弱毒菌株Vn-1的诱导抗性机制。通过分析不同处理组之间基因表达差异、GO富集分析及KEGG富集分析，筛选出与抗病相关的差异表达基因，如：编码抗病相关蛋白基因、钙离子结合相关蛋白基因、谷胱甘肽转移酶相关基因、果胶酯酶相关基因等。筛选出谷胱甘肽转移酶相关基因（HannXRQ_Chr02g0053931、HannXRQ_Chr04g0125131）、果胶酯酶相关基因（HannXRQ_Chr03g0082311）、磷脂酰肌醇4-激酶γ4（HannXRQ_Chr04g0120561）多个基因，已完整克隆相关基因的CDS编码区，构建植物双元表达载体并转化农杆菌。通过农杆菌浸染法，侵染本氏烟草叶片，进一步进行基因功能验证。.除本项目计划外，还从代谢物质层面研究弱毒菌株诱导向日葵抗黄萎病的代谢机制、向日葵黄萎病和马铃薯黄萎病的拮抗生防菌筛选及鉴定、内蒙古自治区主栽马铃薯品种对于黄萎病的抗性以及田间取样过程中土壤里的杀菌剂含量。同时为下一步研究向日葵抗黄萎病的相关蛋白及代谢物奠定基础。.目前本项目培养已毕业研究生7名，均取得学位。项目投入经费58万元，共支出48万余元，各项支出与预算相符，剩余经费9万5千余元，剩余经费用于本项目后续研究。