调控核盘菌菌核形成相关microRNA的克隆及其功能研究

microRNA（简称miRNA）是真核细胞中一大类参与基因转录后调控的非编码小分子RNA，在动植物细胞的生长和发育等过程中发挥着重要作用。但有关miRNA在植物病原真菌生长发育过程中的作用还鲜为人知。在前期研究中我们以重要植物病原真菌核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）为材料，利用Solexa技术对核盘菌的小RNA文库进行了测序，并结合生物信息学手段预测出了一些miRNA候选基因。因此我们拟进一步利用Northern杂交等技术验证这些miRNA基因的存在，并检测其在核盘菌发育不同阶段的表达水平，筛选出与菌核形成密切相关的miRNA；最后利用基因过表达和敲除技术验证相关miRNA的功能，阐明其在核盘菌菌核形成过程中的作用。本研究结果将有助于我们全面了解核盘菌的菌核形成机制，对发展新的菌核病防控技术具有非常重要的理论意义和应用价值。

microRNA（简称miRNA）是真核细胞中一大类参与基因转录后调控的非编码小分子RNA，在动植物细胞的生长和发育等过程中发挥着重要作用。但有关miRNA 在植物病原真菌生长发育过程中的作用还鲜为人知。在本项目中我们以重要植物病原真菌核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）为材料，利用Solexa技术对核盘菌的小RNA文库进行了测序，总共获得了13,229,401高质量的reads，其中5,645,718个reads能完整匹配到核盘菌的基因组上，这些reads对应了348,108个单一的小RNA序列。通过生物信息学方法预测这些小RNA及其两端序列的二级结构，我们预测出了2个microRNA-like RNAs (milRNAs)和42个milRNAs候选分子。对这些候选的milRNA基因，我们首先利用Northern杂交验证这些miRNA基因成熟体的存在。并利用荧光定量PCR技术检测了其在核盘菌发育不同阶段的表达水平，筛选出了7个与核盘菌菌核形成密切相关的milRNA或milRNA候选分子，我们还利用生物信息学手段预测了这些miRNA的靶基因。为了进一步研究明确小RNA在核盘菌菌核形成过程中的作用，我们在核盘菌中利用同源重组原理敲除了小RNA加工过程重要基因DCL-1，研究发现该基因敲除后对核盘菌的生长无明显影响，但能显著影响核盘菌的菌核形成，导致出现菌核形成推迟，菌核变小等表型，结果进一步确定小RNA在核盘菌菌核形成过程中起重要作用。同时利用项目过程中建立起来的真菌小RNA研究平台，我们也研究了核盘菌重寄生真菌盾壳霉的小RNA及其功能，并进一步证实了小RNA在真菌的发育过程中起重要作用。项目的研究结果有助于我们从新的角度了解核盘菌的菌核形成机理，并将为新的菌核病防控方法提供思路和靶标。