油菜蜂花粉活性成分保肝作用分子机制研究

本项目在证实油菜蜂花粉中含有能够有效清除自由基、抗脂质过氧化、保护肝脏的活性成分研究基础上，通过多种色谱分离方法从蜂花粉中分离纯化具有保肝活性的单体化合物，用光谱、波谱分析手段进行结构鉴定，利用现代医学、分子生物学技术和药理实验方法及参考保健食品功能测定方法，从酶活性、Ca2+浓度的变化、蛋白及基因调控等角度，探讨油菜蜂花粉中活性成分对肝脏的保护作用。在此基础上，从整体动物水平、细胞水平和基因水平，进一步深入系统地研究花粉活性成分对四氯化碳、卡介菌加脂多糖、酒精致损伤肝脏的保护和修复作用；并着重从抗氧化、病理形态、细胞凋亡、基因及蛋白调控等方面探明花粉活性成分对不同种类肝损伤的抑制作用及其分子机制，为蜂花粉的开发利用拓宽途径，为花粉活性成分作为保肝保健食品的开发利用提供理论基础和科学依据。同时也为系统深入了解花粉活性成分对肝脏保护作用机制提供可借鉴的思路和方法。

目的:建立L02肝细胞四氯化碳化学性损伤模型，采用色谱层析手段对油菜蜂花粉进行分离纯化，用质谱和核磁方法鉴定各成分的结构，以L02细胞存活率为指标追踪各层析组分/成分的保肝活性，从氧化应激角度考察花粉活性成分保肝作用机制。.实验结果如下:1.油菜蜂花粉保肝活性成分的分离纯化采用了溶剂萃取、ODS柱层析、高效液相色谱法，最终得到四个黄酮苷P2~P5以及一个含有P1和P2的混合组分C1，经质谱和核磁鉴定P2~P5依次为QMP、KMG、SMP、KMP，其中SMP属首次从油菜花粉中分离得到。2. 油菜蜂花粉保肝活性成分的细胞学筛选以四氯化碳诱导人正常肝细胞为体外细胞损伤模型，采用MTT法测定细胞存活率并以其作为活性筛选指标，结果表明分级萃取物中正丁醇萃取物活性最高，对其进行层析分离，各洗脱组分中A2活性最高，进一步分离纯化及细胞学筛选最终得到一个活性化合物QMP和一个活性组分C1，两者的保肝活性与剂量呈正相关，其中高剂量组细胞相对存活率分别为模型组的2.64和2.66倍。3. 以细胞存活率的IC50值结果探讨油菜黄酮苷及其苷元的构效关系，发现油菜黄酮苷QMP、KMP、KMG的羟基糖基化使得其活性低于自身苷元，黄酮醇C3’-OH的强电离能力使得槲皮素表现出比山奈酚更强的保肝活性。4.活性成分保肝机制的研究从氧化应激的角度选择SOD、MDA、LDH为指标进行考察，结果显示油菜黄酮苷QMP及苷元山奈酚、槲皮素的干预使胞内抗氧化体系活力增强，细胞膜稳定性增强，极大的减轻四氯化碳致损L02肝细胞的脂质过氧化水平，对四氯化碳引起的氧化损伤具有显著的保护作用。.结论:油菜蜂花粉保肝有效成分为黄酮苷成分，代表成分为QMP，可使四氯化碳致损L02肝细胞内抗氧化体系活力增强，细胞膜稳定性增强，极大的减轻脂质过氧化水平，对四氯化碳引起的氧化损伤具有显著的保护作用。