玉米大斑病菌水甘油通道蛋白StFps1基因的克隆与功能研究

本课题组在前期研究中初步明确了玉米大斑病菌HOG-MAPK信号转导通路中一个MAPK基因（STK1）的功能，发现该基因不仅对病菌的渗透胁迫反应有重要的调控作用，还参与调控病菌的菌丝发育及致病性等过程。研究表明，在许多真核细胞中水甘油通道蛋白是HOG-MAPK途径下游的靶蛋白，在调控细胞渗透胁迫反应上有重要作用。本研究拟采用候选基因法、RACE、Genome Walking等技术克隆玉米大病菌水甘油通道蛋白基因StFPS1；利用GFP标记、ATMT技术对StFps1进行亚细胞定位；利用TGM、RNAi、Gene overexpression等技术研究该基因的功能；利用免疫共沉淀、酵母双杂交技术，探讨STK1与Fps1之间的互作关系。研究结果不仅将进一步明确玉米大斑病菌HOG-MAPK信号转导通路的渗透调节机制，也为深入研究病菌的致病机制奠定基础。

由玉米大斑病菌所引起的玉米大斑病是玉米生产上的重要真菌性病害，该病害有逐年加重的趋势，因此，探索影响病菌生长发育及致病性的调控机制、寻求病害防治的新途径已迫在眉睫。本研究按照项目计划书的要求，主要进行了玉米大斑病菌水甘油通道蛋白基因StFPS1的克隆、基因功能研究、亚细胞定位、StFps1与Stk1互作等方面的研究，同时也对研究内容做了一定扩展，包括玉米大斑病菌MIPs超家族蛋白的鉴定、高渗胁迫下病菌的转录组研究、高渗胁迫物质的确定等内容。主要研究结果为：①克隆了玉米大斑病菌水甘油通道蛋白基因StFPS1，该基因DNA全长为1393 bp，cDNA全长为1179 bp，含有4个内含子，5个外显子；聚类分析发现，StFPS1与酿酒酵母的FPS1基因有较高的同源性。②利用RNAi及基因敲除技术阐明了StFPS1基因的功能，发现StFPS1基因参与病菌菌丝发育及分生孢子的产量；StFPS1基因参与病菌高渗胁迫反应，且起负调控作用；StFPS1基因不参与调控病菌毒素产生和胞壁降解酶活性，但StFPS1基因与病菌细胞壁的形态建成密切相关；StFPS1基因影响玉米大斑病菌附着胞发育及侵染能力； StFPS1基因沉默不仅干扰了HOG-MAPK途径，也干扰了细胞壁完整性MAPK（CWI-MAPK）途径；StFPS1基因参与病菌的氧胁迫及温度胁迫反应。③对StFps1的生物信息学分析及亚细胞定位初步结果表明该蛋白位于细胞膜上。④初步推测在病菌中的MAPK基因（STK1）很可能是通过另一蛋白（StRgc2）作为中介来来调控水甘油通道蛋白的启闭的，从而能调控病菌的高渗胁迫反应。⑤从全基因组水平鉴定了玉米大斑病菌MIPs超家族蛋白。⑥高渗胁迫下玉米大斑病菌的转录组分析表明，在高渗胁迫下，发现2706个基因表达与对照具有显著差异，1503个基因表达上调，1157个基因表达下调；对上述基因进行KEGG代谢途径分析发现，差异表达基因富集在脂肪酸降解、脂肪酸生物合成以及ABC转运等8个代谢途径中。⑦利用HPLC分析表明，玉米大斑病菌菌丝中的主要渗透调节物质为甘油、海藻糖和甘露醇。该研究不仅为阐明玉米大斑病菌生长发育的调控机制及高渗胁迫下病菌代谢调控机制提供依据，也为阐明病菌的致病机制提供理论依据。