CWI-MAPK途径对玉米大斑病菌细胞壁发育及致病性的调控作用

In our preliminary research, we cloned a mitogen-activated protein kinase kinase kinase (MAPKKK) gene named StBCK1 from Setosphaeria turcica, and obtained gene knockout mutants and found that the mutants lost integrated cell wall and pathogenicity, suggestting that cell wall integrity MAPK (CWI-MAPK) cascade pathway probably regulate cell wall development and pathogenicity in the pathogen. In this research, single gene knockout mutants, double gene knockout mutants, revertant mutants, over-expression mutants will be employed to confirm the regulation functions of cell wall components, cell wall structures, and susceptibilities in the fungus. These mutants will be also used to analyze the crucial roles in conidiospore formation, appressorium development, infection processs, and so on. Furthermore, the downstream target proteins in the pathway will be obtained by searching S. turcica protein sequence database, screening S. turcica yeast two-hybrid cDNA library screening, applying bimolecular fluorescence complementation (BiFC) technonglogy. The functions of 3 candidate downstream target proteins will be further analyzed in this research. The research will not only improve the understanding of the components and functions of CWI-MAPK cascade pathway but also lay the foundation for the development of new antifungal agents.

本课题组前期研究发现，玉米大斑病菌CWI-MAPK级联途径中的StBCK1基因（MAPKKK）敲除突变体细胞壁发育不完整、致病性丧失，初步确定该级联途径参与调控病菌细胞壁发育及致病过程。本研究拟通过进一步分析StBCK1、StMKK （MAPKK）和StSLT2（MAPK）单/双基因敲除、回复和过表达突变体在细胞壁结构与成分、敏感性等的变化,阐明该途径在病菌细胞壁发育中的作用；通过分析上述突变体在分生孢子形成、附着胞发育、侵染过程等的改变，解析该途径对病菌致病性的调控作用；通过搜索玉米大斑病菌蛋白质序列数据库、筛选酵母双杂交cDNA文库并利用BiFC技术确定该途径下游靶蛋白；对其中2-3个靶蛋白进行功能分析，明确其在病菌细胞壁形成和致病性中的作用。该研究结果不仅完善了对玉米大斑病菌CWI-MAPK级联途径的结构和功能的理解，也将为研发新型杀真菌制剂奠定基础。

本研究按照项目计划书的要求，主要针对玉米大斑病菌CWI-MAPK级联途径的关键基因及其下游调控靶基因的功能进行了比较系统的研究，旨在阐释该途径作用的分子机制。同时我们也对研究内容做了一定扩展，探索了StKU80基因敲除突变体能否作为靶基因敲除的受体菌株，初步尝试在该病菌中建立基于CRISPR/Cas9技术的靶基因编辑体系，以提高病菌靶基因的敲除效率。主要研究结果为：①克隆了StBCK1基因（MAPKKK），其DNA全长为5064bp，不含内含子，编码1687个氨基酸，在多肽链的N端的1396-1655aa处存在典型的1个S_TKc保守结构域。进一步利用靶基因敲除和过表达技术明确了该基因的功能，结果表明，StBCK1参与病菌菌丝、分生孢子、细胞壁及附着胞的发育，负调控高渗胁迫反应，但与HT-毒素的毒性无关。②克隆了StMKK1基因（MAPKKK），其DNA全长为2262bp，cDNA为1485bp，具有MAPKK类基因的S_TKc保守结构域。进一步利用靶基因敲除技术分析了其功能，发现StMKK1参与调控病菌菌丝、分生孢子及细胞壁发育，并参与调控病菌的氧胁迫反应。③克隆了StSLT2基因（MAPKK），发现该基因DNA全长为5842 bp，cDNA为3105 bp，含有12个内含子，13个外显子。获得了该基因敲除转化子，对该基因的功能分析尚在进行中。④初步筛选得到了很可能受CWI-MAPK级联途径调控的下游转录因子（StRLM1、StRLM2、StSWI4、StSWI6）。⑤克隆了非同源末端连接（Nonhomologous end joining, NHEJ）途径中的关键基因StKU80，其DNA全长为2439 bp，cDNA为2199 bp，包含5个外显子和4个内含子，StKU80p包含KU70p/KU80p蛋白所特有的保守结构域（vWa、Ku78和Ku-PK-bind），进一步利用靶基因敲除技术，发现该基因参与调控病菌菌丝、分生孢子、附着胞的发育，并参与病菌的氧胁迫反应。由于该突变体与野生型菌株在生长发育方面具有显著差异，因此不能作为靶基因敲除受体用于其他基因功能的研究。⑥在玉米大斑病菌中初步建立了基于CRISPR/Cas9技术的靶基因敲除体系。