水甘油通道蛋白在NAFLD发生、发展中作用的实验研究

随着饮食结构的改变和生活方式的变化，NAFLD已变成危害人类健康的主要消化道疾病之一，及早发现和治疗已成为全人类的共同心意。NAFLD发生、发展与脂肪重新分布有关，而脂肪的合成、运输和肝脏摄取又与AQP7、9有一定的相关性。在正常情况下，由AQP7、9协调完成了甘油从脂肪细胞到肝脏的运输过程，因此本项目以AQP7、9为研究对象，在充分认识AQP在脂肪重新分布等功能基础上，一方面以AQP7 cDNA为目的基因，构建重组质粒，并在减毒沙门氏菌中表达，随后接种动物模型，以补充机体的AQP7，加速脂肪细胞甘油输出，减少脂肪细胞脂肪合成；另一方面以AQP9 cDNA为靶基因，构建pshRNA-AQP9载体，在体内外，探讨siRNA沉寂肝细胞AQP9的表达，以减少甘油进入肝细胞，减少肝细胞脂肪合成和积累，从而达到有效预防和治疗肝脂肪变性的目的，从本质上遏制NAFLD的发生、发展奠定理论与实验基础。

构建pEGFP-N1-AQP7、pEGFP-N1-AQP9及pshRNA-AQP9重组质粒，验证其对L-02细胞AQP9表达的影响及脂肪变性的作用，将重组质粒转化入减毒沙门氏菌构建重组SL7207疫苗株同时利用慢病毒相关RNA干扰技术下调高脂饮食诱导NAFLD大鼠模型肝AQP9的表达，抑制肝脏对甘油的吸收，探索AQP7、AQP9在NAFLD发生发展中所产生的生理效应，为两者非酒精性脂肪肝病的基因治疗奠定基础。方法和结果：（1）从人脂肪及肝脏组织中提取总RNA，通过RT-PCR获得AQP7和AQP9基因克隆到pEGFP-N1质粒上，构建重组质粒pEGFP-N1-AQP7和pEGFP-N1-AQP9转染COS-7真核表达细胞，验证了其在COS-7细胞中表达并与绿色荧光蛋白融合；（2）构建针对人AQP9的干扰质粒pshRNA-AQP9转染L-02肝细胞，通过RT-PCR和Western blot检测其抑制效率，筛选出了对L-02细胞AQP9干扰效果明显的重组质粒；（3）将pEGFP-N1-AQP9及pshRNA-AQP9分别转染油酸诱导脂肪变性的L-02细胞，检测两者对其脂肪变性程度分别有加重及减轻作用；（4）将基因片段转化入减毒沙门氏菌SL7207成功构建SL7207/pEGFP-N1-AQP9及SL7207/pshRNA-AQP9；（5）将6-7周龄雄性SD大鼠随机分为正常组、高脂组、对照组和转染组，每组5只，其中正常组用普通饮食、其余3组用高脂饮食喂养8周。后3组在喂养前一天通过肝门静脉注射转染方式分别予以等量的PBS溶液、lentivirus-scramble及lentivirus-shRNA-AQP9。8周后处死，运用蛋白免疫印迹、组织免疫组化及实时荧光定量PCR技术观察到转染组大鼠肝脏AQP9mRNA和蛋白表达量及肝实质细胞膜上AQP9蛋白的表达较其他组明显减少；通过肝组织切片HE、油红O染色观察到转染组大鼠肝实质细胞内甘油三脂沉积量较其他组显著减少。结论：建立L-02肝细胞脂肪变性模型转染pEGFP-N1-AQP9上调AQP9的表达可使其脂肪变性程度加重，反之转染pshRNA-AQP9下调表达能使其减轻，重组lentivirus-shRNA-AQP9转染大鼠后成功减轻肝细胞脂肪变性程度，提示AQP9在肝细胞脂肪变性以及NAFLD发生发展过程中起着重要作用。