深海嗜压菌水通道蛋白基因的高效表达和功能特性研究

The development of aquaporins with high permeability in biomimetic membrane applications has become one of the most promising research areas. The novel water channel protein- Aqp SS9 from deep-sea Photobacterium profundum SS9 has been cloned in our pilot study. The Bac-to- Bac/ BmNPV Baculo-virus expression system and cell free expression system wil be developed for the efficient and functional expression of AqpSS9. Biomimetic membranes integrated with protein AqpSS9 will be prepared by vesicle fusion and Langmuir-Blodgget methods, respectively. Also, the effect of substrate structure on stability and function of biomimetic membranes will be investigated. This would be helpful in preparation of water filter based on biomimetic membranes not only with high permeability and specificity and Low energy consumption, but also with the tolerance to high pressure and high salt concentration. Systemetic analysis methods will be developed to evaluate the structure and function of the biomimetic membranes. Different qualities of mesoscopic structure caused by the interactions of AqpSS9 and biomimetic membrane with substrate will be investigated, which may affect the performance of macroscopic water filter. The complicated principles of integration and reconstruction of AqpSS9 will be clarified. At the same time, it will provide strong evidences for revealing the extremophilic mechanism of deep sea biologies.

开展水通道蛋白的超强滤水功能在多领域的仿生应用是最具吸引力的研究方向之一。本项目从深海嗜压嗜盐菌SS9 中克隆水通道蛋白AqpSS9 基因，开发AqpSS9 的家蚕杆病毒表达系统和无细胞体外合成系统，以实现其高效功能性表达。通过囊泡或脂质体融合法、LB 制膜等手段，制备整合AqpSS9 蛋白的生物模拟膜。并研究支撑结构对模拟膜稳定性和功能的影响。以期形成既具专一性强、水渗透性高、低能耗等优点，又有耐压和耐盐特性的生物模拟膜滤水元件。建立较为系统的模拟生物膜结构及功能的分析方法。探讨包括高压、高盐等环境下，模拟生物膜中水通道蛋白、膜基质和支撑结构间相互作用所导致的各种自组装介观结构性质、介观结构间的相互作用与宏观功能性的关系。阐明复杂的水通道蛋白整合和实现功能重建的基本规律。同时，也为揭示深海生物嗜极现象产生机制提供有力的实验证据。

首次提出从海洋嗜压菌Photobacterium profundum SS9中寻找适于制备滤水仿生膜的水通道蛋白，并成功克隆表达了AQPSS9。从模板设计、细胞抽提物、能量系统等方面研究和开发了针对膜蛋白的无细胞表达体系。在无细胞体系中，比较研究去污剂重悬（P-CF）、直接添加去污剂（D-CF）、直接添加脂质体（L-CF）的表达策略，实现AQPSS9高效可溶性表达，并纯化了AQPSS9。停留光谱等分析证实AQPSS9具有高效的滤水特性，并能有效截留盐分，其性能接近或优于典型水通道蛋白AQPZ。通过囊泡铺展和层层组装平板膜方法分别制备了嵌入AQPSS9和AQPZ的滤水仿生膜。利用红外光谱、原子力显微镜、扫描电镜等方法表征分析了仿生膜制备过程中的表面和膜断面形态的变化。在截流反渗透方式以及正渗透方式下，分析了嵌入水通道蛋白的滤水仿生膜的水通量和截盐率等分离指标，进一步确证了AQPSS9具有与AQPZ相似的主动滤水性能。利用基因编码非天然氨基酸技术，在大肠杆菌无细胞体系中实现AQPSS9特定位点引入非天然氨基酸，使其可与磷脂发生共价结合。结果表明非天然氨基酸的嵌入没有影响水通道蛋白AQPSS9的滤水和盐截留性能。这为进一步制备稳定型高性能滤水仿生膜提供了新的思路。