深海细菌Pseudomonas marincola的氧化还原酶高通量挖掘、特异性研究与应用

应用所创立的藉助酶标仪高通量同时测定单一微生物多种氧化还原酶的新方法于海洋微生物氧化还原酶资源的挖掘与酶特异性研究，构建氧化还原酶高通量挖掘平台；基于所发现的深海微生物Pseudomonas marincola 3#2含有众多非同寻常的无需辅酶可检测到氧化还原酶活性及其多为膜结合酶等特异性，通过对该菌株氧化还原酶酶组学的研究，阐明酶活随时间变化的规律和各种酶与中心碳代谢氧化还原酶的关系，从分子水平研究极端条件下海洋微生物的适应性及其与环境的相互作用的规律；对P. marincola 3#2氧化还原酶（如活性较高的甘油脱氢酶或黄嘌呤脱氢酶）进行纯化、晶体培养和衍射分析，探讨其结构和功能的关系，阐明其特殊催化机制；开创二羟基丙酮、甲酸、甲醛和甲醇等相应化学品的P. marincola或其定向进化菌全细胞催化制备技术，为其他海洋微生物氧化还原酶挖掘和生物催化与转化技术开发提供示范。

通过建立海洋菌氧化还原酶高通量检测平台并运用该平台开展一系列海洋菌氧化还原酶挖掘、性能考察和应用研究，获得如下重要结果、关键数据及其科学意义：（1）通过研究16株海洋微生物菌株中心碳代谢（CCM）的氧化还原酶酶组学及其对培养时间的应答，探讨了葡萄糖浓度对Pseudomonas菌株CCM关键氧化还原酶活性的影响，发现环境和地理因素会影响亲缘关系很近的菌株体内CCM途径的氧化还原酶的动态活性，否定了以往普遍认为亲缘关系较近的菌株其CCM相差无几的观点；应用该方法可直接且准确研究不同培养条件下产物合成途径的差异；（2）筛选获得了高活性苹果酸脱氢酶的海洋菌株，进一步研究了温度、碳源及金属离子等对产酶的影响，研究了该菌细胞生长、蛋白浓度及酶活与时间的关系，发酵25h后苹果酸脱氢酶的活性高达72.6 U/mg，该菌株拥有相对耐低温及耐寡营养等优点；（3）筛选获得具有亮氨酸脱氢酶（LeuDH）活力的海洋菌株。通过生物信息学考察海洋来源的亮氨酸脱氢酶与陆地来源的同源性；克隆和表达了海洋微生物亮氨酸脱氢酶基因，并研究其理化特性和通过全细胞催化反应制备L-叔亮氨酸，收率为54.6%、e.e.值大于99.0％；（4）筛选到可催化系列酮不对称还原胺化，具有良好的催化活性和选择性的胺脱氢酶，该酶对苯乙酮和3-庚酮也具有较高的催化活性和选择性，且具有耐有机溶剂、适冷等催化特性，并研究该酶固定化的方法和考察了该固定化酶的性能；（5）通过对来源于海洋菌株的苯丙氨酸脱氢酶基因的克隆和表达，获得一可能是新型的苯丙氨酸脱氢酶，与NCBI数据库比对发现，基因序列最高相似性仅为71%，氨基酸序列最高相似性仅为80%。该酶的多聚体的大小为400 kDa左右，可能是尚未报道的9或10聚体。不同pH缓冲溶液中加入1 MNaCl可以显著增强该酶的稳定性。该酶在甲醇、乙醇、乙二醇、乙二醇单乙醚、丙酮中具有较好的耐有机溶剂性和稳定性。