新型黄素依赖的亚胺还原酶的挖掘与应用研究

Chiral amines are a class of very important building blocks widely used in pharmaceuticals and agrochemicals. Imine reductase is the most efficient enzyme for synthesis of chiral amines and is highly significant in industrial application. Currently, almost all of imine reductase reported belong to the G6PD family which is NADPH dependent. Despite having broad spectrum of substrates, enzymes of this family are generally poor to catalyze bulky and linear imine substrates, which severely restrict their application. In our previous studies, we identified a new flavin-dependent imine reductase CycK. Based on chemistry and structral biology study, this enzyme was confirmed having a typical fold of ACAD family. A large number of sequences homologous to CycK in Genebank were further discovered by genomic analysis, suggesting that these enzymes indeed belong to a new family of imine reductases. Based on these results, herein we set out to extensively identify other new members in this novel imine reductase family, and systematically investigate their enzymatic properties, catalytic mechanism and protein engineering approach. This study is not only important for discovering a novel family of imine reductase, but also can potentially provide an effective way to solve the limitations of existing G6PD family.

手性胺是一类非常重要的核心结构单元，亚胺还原酶是酶催化合成手性胺最有效和最具有工业应用前景的一类酶。目前广泛使用的亚胺还原酶均属于G6PD家族，其催化活性依赖于NADPH；尽管具有较大的底物宽泛性，这一家族的酶普遍对大位阻底物和线性亚胺底物催化效率低下，限制了其广泛的使用。在前期研究中，我们发现了一例新型的黄素依赖的亚胺还原酶CycK，通过生化和结构生物学的研究，证实其属于ACAD家族。基因组学分析发现Genebank中存在着大量CycK的同源的序列，暗示着一个全新的亚胺还原酶家族。因此本研究中，我们以这例特殊的亚胺还原酶为基础，对这一全新的亚胺还原酶家族中的成员进行系统的挖掘，以及酶学性质、催化性能以及酶工程改造等方面的探索。新家族的亚胺还原酶的挖掘和研究，不仅是对亚胺还原酶的重要拓展，还可能是解决现有报道的亚胺还原酶普遍存在的问题的有效途径，为手性胺的生物催化合成提供重要的促进作用。

手性 1-芳基-四氢-β-咔啉 (THβC) 是一类广泛存在于天然产物和药物中的重要核心结构单元。由于框架的庞大和刚性，使得利用酶催化还原1-芳基-二氢-β-咔啉 (DHβC)获得THβC化合物非常具有挑战性。亚胺还原酶（IRED）在对映选择性合成手性胺的应用中很有吸引力，在这项研究中，通过对空间位阻耐受性亚胺还原酶IR45 与1-苯基二氢-β-咔啉 (DHβCs)的分子对接和突变分析，的关键结合模式，发现通过对亚基 B 中 L228'、M250' 和 E251' 的关键残基残基的改造，大大扩展了酶的底物耐受性，从而能够高效、立体选择性地合成一系列邻位、间位、对位和多取代 (S) -1-苯基-THβCs。通过在结合酶促亚胺还原和全细胞 N-甲基化反应，我们进一步开发了一种两步一锅的高催化效率而且经济的策略，可以从 DHβC 底物直接合成 (S)-N-甲基 1-苯基-THβCs。我们的研究结果不仅为重要的 1-芳基 THβC 框架的合成提供了一条有效途径，而且还显着扩展了 IRED 的底物特异性，这将有助于 IRED 在合成其他大位阻胺中的广泛应用。