多酶生物分子机器的可控组装与制备药物的生物化工基础

This research project is designing and creating novel biological function oriented biomolecular machines controllably assembled by multenzyme system. The biomolecular machines which coupling the alcohol dehydrogenases (ADH) and amino acid degydrogenases (AADH) will catalyze cascade reaction to obtain high-value chiral drugs D/L-amino acids from hydroxy acids. The structures of ADH and AADH will be modified by the combination of the directed evolution, rational design, semi -rational design and chemical modification to improve the activity, stability and selectivity. Based on the characteristic of enzymes and peptides, the bank of peptide anchors will be constructed. The peptides with different structures, namely cycle, linear, and spiral, will be rationally designed by dynamic simulation, and genetically fused to the enzymes to self-assemble the biomolecular machines. The coordination of multienzymes will be investigated by kinetic study. Relying on synthetic biology, the biobricks and genetic ci rcuit will be made to optimize the structure of biomolecular machines by gene expression and whole-cell catalysis. The ability of these nanodevices to facilitate biotransformations will be tested to reveal the connection of nanostructures and catalysis efficiency. The new methodologies arising from this project will provide access to biomolecular machines and have great potential for the understanding of the controllable multienzyme system.

以构建具有多酶有序催化功能的可控生物分子机器为导向，以所提出的醇脱氢酶（ADH）和氨基酸脱氢酶（AADH）耦联催化羟基酸制备手性药物D-型或 L-型氨基酸为例，并用定向进化、理性设计、半理性设计、化学修饰等技术改造 ADH、AADH 的构型和构象，提高其催化活性、稳定性和选择性等性能；基于酶与各种多肽间的化学键特性，构建有序可控组装不同酶的连接元件库，应用分子动力学模拟等生物信息学方法优选 ADH 与AADH的连接元件并构筑不同空间构型的生物分子机器，研究不同生物分子机器中多酶协同作用的规律、催化动力学和最佳构型；应用合成生物学技术构建相应生物砖和基因电路，通过克隆和表达实现胞内生物分子机器的组装并优化工程菌培养条件和全细胞催化工艺。多方位研究不同构型生物分子机器用于制备药物的反应和传递特性，揭示其微观结构与表观性能间的内在关系和调控规律，为生物分子机器的有效构建和系统开发提供科学依据。

手性氨基酸(天然或非天然L-氨基酸和D-氨基酸)是合成手性药物、手性农药和手性食品添加剂等精细化工品的关键中间体。目前，药用氨基酸中间体原料除天然氨基酸外，许多新药(如蛋白酶抑制剂类、抗艾滋病药等)均使用人工合成的非天然手性氨基酸。构建用于非天然手性氨基酸制备的系统化、高效的多酶生物分子机器，有助于推动环境友好型生物催化合成医药、化妆品和营养化合物的发展。..本项目以多酶生物分子机器的可控组装与药物制备的功能开发为总体目标，构建用于非天然手性氨基酸制备的系统化、高效的多酶生物分子机器。首先，针对酶分子结构与功能构效关系的关键科学问题，利用扫描隧道裂解技术（STM-BJ）解析甲酸脱氢酶反应过程中酶和辅酶自组装复合体的电荷传输变化，通过分子动力学模拟结构动态变化解析亮氨酸脱氢酶的盐适应性机制，解析了甲酸脱氢酶 (FDH) 、 (R)-羰基还原酶（RCR）、苯丙氨酸脱氢酶（PheDH）的底物识别规律与手性催化机理；其次，针对连接元件间化学键相互作用规律的关键科学问题，构建多种多酶生物分子机器，包括共价键介导的多酶分子机器、蛋白多聚作用力介导的多酶生物分子机器、支架蛋白定向耦联介导的多酶分子机器、静电力寡肽介导的多酶分子机器，并研究了元件组装机制与多酶催化通道效应；最后针对多酶生物分子机器催化过程调控规律及其效率强化的关键科学问题，运用多种固定化材料与策略实现对单酶体系与多酶体系的固定化，利用合成生物学手段构建多种生物砖与基因回路用于手性药物中间体的有效生物合成与高性能生物催化剂的筛选，基于菌株筛选与数据库挖掘、初步建立具有工业属性的酶资源库，优化了多条生物法不对称合成反应的工艺。.项目主要研究内容按计划执行，并达到预期研究目标，为生物分子机器的胞内、外有效组装和功能开发提供科学依据和奠定理论基础，同时也为多酶生物分子机器制备非天然手性氨基酸打下了坚实基础。