并用NADH和NADPH生物转化甘油制备1,3-丙二醇的合成生物系统研究

单一辅酶有限还原力已成为生物法转化甘油生产1,3-丙二醇的瓶颈，通过扩展可利用的辅酶资源可以提高转化效率。为了实现NADH和NADPH两种辅酶的优化并用，本课题研究具有不同辅酶依赖特性的1,3-丙二醇氧化还原酶及其它甘油代谢关键酶的分子改造、不同辅酶依赖性的1,3-丙二醇氧化还原酶的并用和1,3-丙二醇合成生物系统地构建与运作。首先，运用蛋白质虚拟定点突变和饱和突变工具，结合基于序列的氧化还原酶辅酶依赖型自动判别模型，力求实现此类新酶的高通量筛选，并为研究辅酶依赖特性的分子基础问题提供新的思路和方法；其次，基于合成生物学的高效技术体系，标准化甘油代谢途径的关键酶，分别构建有关元件库、基因环路装置库及具有不同并用辅酶特性的合成生物系统，实现1,3-丙二醇的高效生产，并为探讨辅酶并用机制提供新的生物砖和数据。其研究成功，可为其他生物化学品合成生物法生产开辟先河和提供科学依据。

本文利用新兴的合成生物学方法，构建了编码基因分别为dhaT基因和yqhD基因的两类生物砖元件，可相应地表达出依赖于辅酶NADH和NADPH的1,3-丙二醇氧化还原酶(PDOR)及其同工酶(YQHD)。在此基础上，研究了不同生物转元件的表达效率，并对1,3-丙二醇氧化还原酶最优培养条件和酶活性质进行探讨。然后，研究甘油脱氢酶基因gldA的克隆与表达；融合酶基因yqhD-gldA的构建与表达；甘油脱水酶基因dhaB的克隆；NADH氧化酶基因表达的突变菌株构建；构建诱导裂解回路释放重组蛋白和用于1,3-丙二醇发酵的菌株代谢进化。.主要内容和结果如下：（1）构建了分别编码1,3-丙二醇氧化还原酶PDOR及其同工酶YQHD的基因dhaT和yqhD的生物砖元件库。dhaT与yqhD基因分别源自Klebsiella pneumoniae和E. coli，通过PCR扩增，并将其标准化。根据生物砖标准组装方法依次将RBS、T7 promoter、TT terminator与目的基因dhaT和 yqhD连接，构建成具有不同表达效率（RBS1.0、RBS0.6、RBS0.3、RBS0.07）的生物砖1,3-丙二醇氧化还原酶及其同工酶库；（2）考察了pSB1A2-T7-RBS-dhaT-TT蛋白表达系统的表达条件。与优化前的酶活力相比，基于RBS1.0的酶活力显著提高，粗酶活由52 U/ml提高到211 U/ml，比活由12.1 U/mg提高到40.3 U/mg，高于现有文献报道值；（3）考察了1,3-丙二醇氧化还原酶无细胞抽提液的酶学性质。结果表明该酶的最适宜环境为45 ℃，pH 11.0，且该酶在此条件下具备一定稳定性。考察发现Mn2+对酶有极强的激活作用和该酶只对1,3-丙二醇表现出活性；（4）成功地实现甘油脱氢酶基因gldA的克隆与表达；（5 ）成功地实现融合酶基因yqhD-gldA的构建与表达，其中甘油脱氢酶为NAD、NADP兼用型；（6）成功地实现甘油脱水酶基因dhaB的克隆；（7）成功地实现NADH氧化酶基因表达的突变菌株构建；（8）构建诱导裂解回路释放重组蛋白。我们利用标准化生物砖，构建了1,3-丙二醇氧化还原酶诱导表达的lysis裂解回路，在L-阿拉伯糖诱导下，实现了细胞诱导裂解释放重组蛋白；（9）成功地实现用于1,3-丙二醇发酵的菌株代谢进化。