猪整合素β3在PEDV感染过程中的作用

The outbreak of porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) infection has led to severe economic losses in the pig industry. Interaction mechanism of virus and host cells is important theoretical basis of antiviral research. At present, PEDV infection-associated proteins in host cells are not clearly understood. Integrin plays an important role in a variety of virus infections, and is becoming a research focus. In our preliminary study, integrin β3 showed an association with PEDV infection. To confirm the role of integrin β3 in the process of PEDV infection, the techniques and methods,involving in construction of the target protein-expressed cell lines, over expression and silencing of the target genes, flow cytometry, laser scanning confocal microscopy,Co-IP, and GST-pull down, were used for analysis of binding of PEDV with integrin β3, integrin β3-mediated virus entry, interaction of PEDV S protein with integrin β3, and collaboration of integrin β3 with pig aminopeptidase N (pAPN) in sensitive and unsensitive cell lines of PEDV. Theses data will increase the understanding of PEDV infection, and provide some basis for antiviral drug designing of PEDV.

猪流行性腹泻病毒（PEDV）感染的爆发，给养猪业带来严重危害。病毒与宿主细胞互作机制是抗病毒研究的理论基础。目前，在宿主细胞中，PEDV感染相关蛋白尚未得到深入研究。整合素在多种病毒感染中发挥重要作用，日趋成为研究热点。我们前期研究发现，整合素β3与PEDV感染具有相关性。为了进一步明确整合素β3在PEDV感染过程中的作用，本研究拟通过靶蛋白表达细胞系构建、靶基因沉默与过表达、流式细胞术、激光共聚焦显微镜、免疫共沉淀和GST-pull down等方法和技术，在PEDV非敏感细胞系和易感细胞系中，明确整合素β3与PEDV的结合作用，介导PEDV的侵入作用，与PEDV 纤突蛋白（S）的相互作用，以及与PEDV受体猪氨基肽酶N（pAPN）的协同作用，为PEDV感染机制理解及抗病毒药物设计提供理论基础。

猪流行性腹泻病毒（PEDV）在猪群中的持续流行，给我国乃至世界的生猪产业造成巨大的经济损失。然而，PEDV的侵入机制尤其是病毒受体尚不清楚。本项目主要研究整合素αvβ3与PEDV感染的潜在关系。通过对整合素αv和β3亚基的基因序列进行截短和优化，成功构建整合素αv和β3亚基截短基因的原核表达载体系统，利用纯化的蛋白免疫小鼠后获得血清，整合素αv和β3亚基的多克隆抗体效价分别为1:6 400和1:12 800，能识别ST细胞、猪IEC细胞、PK15细胞及仔猪小肠组织中的天然整合素αv和β3蛋白。.将合成的猪整合素αv和β3全基因序列连接至pCAGGS-HA载体上，将重组质粒转染至CHO细胞，共转染组的整合素表达量高于单转染组，转染后24 h~36 h的整合素αvβ3蛋白表达量最高，接种PEDV后，过表达整合素αvβ3蛋白的CHO细胞提高了PEDV感染率。.在PEDV的非敏感细胞Hela和BHK-21细胞中，过表达整合素αvβ3后，进行PEDV感染，在PEDV的黏附、内化和复制过程中，无论添加及未添加胰酶，经qPCR和WB检测，整合素αvβ3过表达后均未使PEDV的量增加。在PEDV的敏感细胞Vero E6细胞中过表达整合素αvβ3后，进行PEDV的感染，在胰酶添加组，整合素αvβ3促进PEDV的内化和复制。在PEDV的宿主细胞猪IEC细胞中过表达整合素αv和β3后，进行PEDV的感染，在胰酶添加组，整合素αvβ3促进PEDV的黏附、内化和复制。.通过将猴整合素αvβ3的siRNA转染至Vero E6细胞后，整合素αvβ3的表达量均下降，PEDV感染后，内化和复制过程被抑制。利用整合素αvβ3的抗体孵育Vero E6细胞后进行PEDV感染，内化和复制过程亦被抑制。以40 μM的RGD肽孵育Vero E6细胞后，PEDV感染后48 h，病毒量被抑制。在稳定表达pAPN的BHK-21细胞中过表达整合素αvβ3后，进行PEDV感染，结果显示，整合素αvβ3与pAPN对PEDV的增殖具有协同作用。.项目组同时研究整合素αvβ3对PEDV变异株的影响，证实整合素αvβ3促进变异株在Vero E6细胞的内化和复制以及在猪IEC细胞内的黏附、内化和复制。.综上，整合素αvβ3促进PEDV在Vero E6细胞和猪IEC细胞内的增殖，增加我们对PEDV侵入机制的理解。