PEDV N蛋白通过p53-DREAM信号通路介导宿主细胞S期阻滞的分子机制

The cell cycle arrest mediated by virus infection is an important process of survival and proliferation of the viruses in the host cell. The clarifying of the mechanism about the virus-mediated cell cycle arrest will provide important theoretical basis for designing of antiviral agents. Porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) can induce the host cell cycle arrest and promote the replication of the virus. However, the molecular mechanism has not been fully elucidated. In our preliminary study, the PEDV N protein-induced cell cycle arrest at S-phase was revealed to be closely associated with p53-DREAM signaling pathway. To reveal the molecular mechanism of PEDV N protein-induced cell cycle arrest at S-phase, the direct effect of PEDV N protein and transcriptional inhibitor complex DREAM, and the indirect regulation of PEDV N protein on the p53-DREAM signaling pathway were investigated by using the flow cytometry, living cell imaging, fluorescent confocal microscopy, Biacore SPR, GST-pull down and Co-IP. Resulting data will provide theoretical basis for the understanding of infection mechanism and designing of antiviral agents of PEDV.

病毒感染介导的细胞周期阻滞是病毒在宿主细胞中存活与增殖的一个重要感染进程。阐明病毒介导细胞周期阻滞的机制，对抗病毒策略设计具有重要科学意义。猪流行性腹泻病毒（PEDV）能介导宿主细胞周期阻滞，促进病毒复制，但是分子机制尚未完全阐明。前期研究发现，PEDV N蛋白介导宿主细胞S期阻滞与p53-DREAM信号通路具有相关性。本研究拟利用流式细胞术、活细胞成像技术、荧光共聚焦显微技术、Biacore SPR技术、GST-pull down和Co-IP等方法，通过研究PEDV N蛋白与转录抑制因子复合物DREAM的直接作用和PEDV N蛋白对p53-DREAM信号通路相关分子的间接调控作用，揭示PEDV通过调控宿主细胞周期促进病毒增殖的分子机制，为深入认识PEDV感染机制以及抗病毒药物设计提供理论基础。

猪流行性腹泻（PED）是由猪流行性腹泻病毒（PEDV）引起猪的一种急性、高度接触性肠道传染病，给我国养猪业带来严重危害。尽管PEDV疫苗在我国广泛应用，PED仍然频繁发生。因此，PEDV防控相关的基础研究十分必要。病毒与宿主长期相互作用过程中，能通过介导宿主细胞周期阻滞创造有利于病毒复制的细胞微环境。鉴于此，阐明病毒调控细胞周期阻滞的机制，能为抗病毒设计提供理论基础。.为明确PEDV N蛋白介导的细胞周期对病毒复制的影响，本课题在非同步化和同步化的Vero E6细胞中发现，N蛋白能介导细胞发生S期阻滞，S期阻滞增强PEDV复制。进一步，为揭示N蛋白诱导细胞S期阻滞的机制，本课题利用活细胞成像系统、免疫共沉淀等方法发现，N蛋白入核后通过NS171-N194区域与p53直接互作，维持p53高水平表达，进而激活p53-DREAM信号通路，介导Vero E6细胞发生S期阻滞。以上结果在PEDV猪源宿主细胞IPEC-J2中得到了印证。为了挖掘PEDV N蛋白介导宿主细胞S期阻滞增强病毒复制关键蛋白，本课题利用TMT标记定量蛋白质组学技术对N蛋白和胸苷阻滞剂介导的S期阻滞状态的Vero E6细胞蛋白表达谱进行了分析。结果显示，在差异表达蛋白中60S核糖体蛋白L18（RPL18）与69个复制/转录相关蛋白存在较强的互作，进一步在在Vero E6和IPEC J2细胞中发现，RPL18增强PEDV经典毒株和变异毒株复制。为获得能干预PEDV N蛋白介导细胞周期S期阻滞的小分子药物，本课题利用分子对接技术、分子层干涉分析等方法筛选发现，小分子化合物金丝桃苷能通过靶向N蛋白S171-N194区域，拮抗N蛋白与p53互作，干预N蛋白介导细胞周期S期阻滞，抑制PEDV复制。为了达到临床应用的目的，本课题通过优化提取工艺，从山楂中提取出高纯度的金丝桃苷（98.79%）。抗病毒试验结果显示，山楂中金丝桃苷显著缓解PEDV引起的临床症状和肠道损伤，仔猪的存活率为75%（3/4），对照组仔猪全部死亡。.综上，本课题阐明了PEDV N蛋白介导宿主细胞周期S期阻滞的分子机制，并且基于该分子机制成功筛选到抗PEDV小分子药物金丝桃苷，进一步在成功提取出了纯度高、且具有抗PEDV活性的山楂中金丝桃苷，为后续应用研究奠定了基础。