线粒体MAVS蛋白在抗H3N2亚型猪流感病毒感染过程中的作用

Swine influenza is common and economically important in pig populations worldwide. It is also a paramount public health concern. Understanding the immune response of the host is requisite in controlling infection. Recently, mitochondrial antiviral signaling (MAVS) protein was demonstrated to have antiviral activity. To evaluate the antiviral role of MAVS on H3N2 swine influenza virus infection in vitro, receptors (TLR7/8, RIG-I/MDA5), adaptor proteins (MAVS, MyD88, TBK1, IRF3/7, NF-κB) and effector factors (inflammatory factor and interferon-I) are quantified. Furthermore, TLR7/8 antagonist and specific siRNA targeting MAVS are utilized to evaluate the effect of the inhibited TLR7/8 and MAVS on the ability of the host to develop immunity to the virus. Finally, animal experiments are done to demonstrate the antiviral role of MAVS in virus-host interactions. This study will contribute to thoroughly understanding the mechanism of immune recognition and clearance of viral infection of the host, and may offer new thoughts to the prevention and control of influenza virus infection.

猪流感是影响养猪业的重要疫病之一，具有重要的公共卫生意义。探讨猪流感病毒感染后宿主的免疫反应对该病的防控意义重大。为阐明线粒体抗病毒信号（MAVS）蛋白这一新型免疫分子在抗猪流感病毒感染的先天性免疫中的作用，本项目拟用H3N2亚型猪流感病毒感染宿主原代细胞（巨噬细胞、树突状细胞、气管上皮细胞），检测与抗病毒先天性免疫相关的两条重要信号通路上的相关受体（TLRs、RIG-I/MDA5）、重要接头蛋白（MAVS、MyD88、TBK1、IRF3/7、NF-κB等）及效应分子（促炎症细胞因子及Ⅰ型干扰素），分析其活性变化规律；进而用TLR7/8拮抗剂及靶向MAVS的特异性siRNA，观察TLR7/8抑制和MAVS信号通路阻断对宿主抗病毒反应的影响；最后通过动物试验，全面揭示MAVS蛋白在猪流感病毒与宿主互作中的作用。研究有助于深入了解宿主识别和清除病毒的免疫机制，为流感病毒的防控提供新的思路。

猪流感是由猪流感病毒引起的一种猪的急性呼吸道传染病，病毒的基因组为分节段的单股负链 RNA，这一特点使病毒能通过基因突变和基因重配不断进化，从而逃避宿主的免疫压力。探究机体感染猪流感病毒后的天然免疫变化和宿主蛋白的抗病毒作用具有重要的理论意义。.在项目总体目标指导下，研究顺利解决了项目执行过程中的关键问题：（1）利用细胞与病毒互作模型，阐释病毒感染后，机体代表性宿主防御细胞针对猪流感病毒产生的先天性应对反应的变化规律及不同细胞表现出的差异；（2）阐明线粒体蛋白MAVS在机体抗H3N2亚型猪流感病毒感染的先天性免疫信号网络的地位及其抗猪流感病毒感染作用。.具体研究内容及结果主要包括以下几个方面：.（1）猪流感病毒能够在猪原代肺泡巨噬细胞或人肺上皮细胞系中有效增殖。病毒感染能引起宿主细胞TLR-3、TLR-7、RIG-I、MDA-5、IRF-7、IFN-α、IFN-β、IL-1β、TNF-α等mRNA显著升高（p < 0.05），表明该猪流感病毒毒株能够有效激活宿主细胞的TLR及RLR信号通路中相关受体及效应因子的基因与蛋白表达。.（2）MAVS通过介导IFN-I的产生抑制猪流感病毒的增殖。发现MAVS能显著激活IFN-β启动子活性，进而抑制病毒的增殖，且MAVS对宿主细胞IFN-I抗病毒通路的活化是必需的。证实CARD结构或跨膜区对MAVS介导的IFN-I的产生至关重要。提示线粒体可能在宿主的天然免疫通路中发挥重要作用。.（3）MAVS介导病毒引起的细胞凋亡。通过过表达试验发现MAVS能显著促进细胞凋亡，并引起Caspase-9、Caspase-3等凋亡相关蛋白表达水平显著升高（p < 0.05），且MAVS对猪流感病毒感染导致的细胞凋亡的发生是必不可少的。发现CARD结构及跨膜区对MAVS介导的细胞凋亡是必不可少的。通过Transwell小室试验发现MAVS介导的凋亡与IFN-I的产生是独立发挥作用的。研究提示MAVS介导的凋亡途径在宿主抗病毒感染中可能发挥着重要的作用。.（4）猪流感病毒相关蛋白对MAVS介导的IFN-I产生及凋亡的影响。发现NS1、PB1-F2能显著降低MAVS诱导的IFN-β启动子活性 （p <0.05），同时NS1蛋白能显著拮抗MAVS介导的凋亡的产生，并呈显著的剂量依赖性（p <0.05）。