基于scFv分子的PEDV细胞受体阻断剂的筛选

猪流行性腹泻（PED）是由猪流行性腹泻病毒（PEDV）引起的一种高度接触性肠道传染病，严重危害我国养猪业的健康发展。目前PEDV疫苗广泛应用的同时，该病仍然存在并经常发生，所以PEDV新的抗病毒策略研究十分必要！本项目以PEDV细胞受体猪氨基肽酶N为研究对象，利用噬菌体展示技术构建猪氨基肽酶N特异性的噬菌体单链抗体库，筛选抗猪氨基肽酶N病毒结合区的高亲和力的单链抗体（scFv），并对scFv编码基因进行体外表达，利用表达的scFv分子来靶向阻断PEDV感染宿主易感细胞。在细胞水平上阐明利用抗猪氨基肽酶N的scFv作为细胞受体阻断剂抑制PEDV侵入宿主易感细胞的可行性，为PEDV的防治及新抗病毒策略的提出奠定理论依据。

本项目以猪流行性腹泻病毒（PEDV）细胞受体猪氨基肽酶N（pAPN）为研究对象，利用噬菌体展示技术筛选pAPN特异性的噬菌体单链抗体、噬菌体随机短肽，同时表达PEDV特异性单抗的单链抗体，通过细胞感染实验验证这些特异性小分子作为PEDV靶向治疗的可行性，为PEDV的防治及新抗病毒策略的提出奠定理论依据。本研究克隆了pAPN的全长基因，获得了pAPN-C亚基的重组蛋白，验证了pAPN-C重组蛋白的抗原性和免疫原性。通过ELISA确定pAPN-C截短重组蛋白rpAPN-C2 (aa 623-722) 和rpAPN-C3 (aa 673-772)是病毒的两个结合区域。利用T7Select10-3b噬菌体展示系统构建了免疫鼠单链抗体库，抗体库容量为2.0×107，构建的抗体库具有良好的多样性。我们利用pAPN-C病毒结合区重组蛋白对构建的pAPN单链抗体库进行了4轮生物淘选，淘选后对获得的高亲和力噬菌体克隆进行测序分析，共获得了4个高亲和力的单链抗体噬菌体克隆，确定了他们的核苷酸序列及推导的氨基酸序列，利用大肠杆菌表达系统对单链抗体进行表达与纯化。为了在后续试验中能对单链抗体进行可溶性表达，我们合成了猪金属硫蛋白基因，利用大肠杆菌对其进行了表达。结果显示，猪金属硫蛋白在大肠杆菌中获得可溶性表达，可以作为后续单链抗体可溶性表达的分子标签。利用pAPN-C重组蛋白对M13 12肽噬菌体随机肽库进行了4轮生物淘选，共获得了14个高亲和力的噬菌体克隆，测序结果显示，14个高亲和力的噬菌体克隆分别展示2不同的氨基酸序列，进一步研究证实“HDAISWTHYHPW”具有一定的抑制病毒作用。最后，利用蛋白质组学技术鉴定了PEDV敏感的Vero细胞膜蛋白表达谱，分析了病毒入侵相关的蛋白，为PEDV其他潜在的受体蛋白挖掘以及后续病毒靶向治疗的设计提供了基础。上述的研究，为PEDV小分子靶向治疗药物及相关抗病毒研究提供了基础。