转录因子fork head对甜菜夜蛾几丁质合成的调控作用研究

几丁质合成是昆虫的一个重要生理生化过程，几丁质合成酶基因（CHS）在昆虫发育、蜕皮和变态、以及繁殖等生命过程中非常重要。然而，转录因子在转录水平上对几丁质合成的调控作用尚知甚少。本项目拟以重要害虫-甜菜夜蛾为研究对象,在前期克隆CHS基因启动子和筛选获得转录因子fork head的基础上，研究fork head的组织和发育表达特性，表达获得重组蛋白后采用凝胶阻滞分析实验(EMSA)，以及pGL3-SeCHS双荧光素酶报告系统鉴定fork head为甜菜夜蛾CHS基因的重要转录因子,并注射fork head的dsRNA或siRNA到甜菜夜蛾体内，检测CHS和几丁质酶基因（CHi）mRNA和蛋白水平上表达的变化，观察几丁质结构及测定几丁质含量变化,阐明fork head对几丁质合成的调控作用，为通过调控害虫的生长发育来控制害虫奠定基础。

几丁质合成是昆虫的一个重要生理生化过程，几丁质合成酶基因（CHS）在昆虫发育、蜕皮和变态、以及繁殖等生命过程中非常重要。然而，转录因子在转录水平上对几丁质合成的调控作用尚知甚少。为了从转录调控水平研究筛选关键的转录因子，研究转录因子调控昆虫的发育过程，明确相关的转录因子对昆虫几丁质合成及对蜕皮和变态过程的调控作用非常必要的。叉头框（forkhead box，Fox）蛋白属于“螺旋-转角-螺旋”类蛋白的一个亚群，是一类从酵母到人类都广泛存在的重要转录因子。Fox家族蛋白功能涉及胚胎发育、细胞周期调控、糖类和脂类代谢、生物衰老、免疫调节等多种生物学过程，其突变和表达异常与发育畸形、代谢性疾病以及肿瘤发生有关。. 本项目主要采用分子生物技术和RNAi技术等方法和手段，采用同源克隆结合RACE技术获得了甜菜夜蛾的一个关键转录因子forkhead，并对其在甜菜夜蛾几丁质合成中的功能进行了研究。主要内容包括：forkhead的克隆及组织和发育表达特性研究；forkhead作为甜菜夜蛾几丁质合成酶关键转录因子的鉴定；研究的重点为forkhead对几丁质合成的调控作用。研究结果发现：（1）转录因子forkhead蛋白拥有两个非常保守的结构域，分别长达85个氨基酸和21个氨基酸；其在脑组织、脂肪体、中肠、表皮、马氏管和精巢等组织都有较高表达，并且该转录因子在甜菜夜蛾不同发育阶段的脂肪体和整体的表达情况不同；Southern Blot分析显示forkhead为单拷贝基因。（2） EMSA和pGL3报告基因活性鉴定结果显示fork head为甜菜夜蛾几丁质合成酶B的转录调控因子。（3）注射dsSeFox 能够有效抑制forkhead水平上的表达，其中蜕皮畸形率达到26.2%，而白化表型达到69.1%；几丁质合成通路中的HK、CHSA和CHSB在mRNA水平上的表达都受到抑制，其中HK基因在RNAi后12h和48h显著下降，CHSA在24h和120h显著下降，CHSB在36h后的表达一直显著低于对照组的表达。. 研究结果阐明forkhead 对几丁质合成的调控作用，为通过调控害虫的生长发育来控制害虫奠定基础。相关研究为深入研究从转录因子水平上调控害虫的发育，筛选合适的靶标基因控制害虫提供了理论依据，对指导甜菜夜蛾等害虫的生物防治和控害效果与机理研究具有一定指导意义。