利用SILAC定向筛选K63泛素连接修饰的蛋白质底物和K63泛素连接新生物学功能的系统研究

泛素是一种高度保守的小蛋白，并通过其自身C-末端甘氨酸的羧基与目的蛋白赖氨酸的ε-氨基共价结合形成泛素化。已连接到蛋白质底物上泛素单体的赖氨酸被后续的泛素分子修饰形成7种不同的泛素连接。其中K6、K11、K27、K29、K33和K48泛素连接引导蛋白质降解分子信号，而K63除主要通过蛋白质聚类、转运、DNA修复等非蛋白质降解功能调节多样的细胞生命活动过程外，也不排除其修饰个别蛋白质底物并引导降解的可能。本研究旨在根据泛素连接结构特征和多重SILAC定量蛋白质组学原理，利用双重标签标记的泛素和纯化技术系统地定向筛选K63泛素连接修饰的目标底物，结合K63泛素连接可能引导蛋白质底物降解的生物学原理定量比较鉴定可能的底物，发现并验证K63泛素连接新生物学功能，并为相关的人类疾病分子机制研究和新药研发提供思路、技术和可能的靶标。

本研究开发了一种正向筛选某一种泛素链特异性底物的方法，通过基因工程改造酵母的泛素基因，构建在同一细胞中两种不同亲和纯化标签标记的人工泛素基因突变体Ub K63（只保留第63位赖氨酸，其它6个赖氨酸被精氨酸替代，简称Ub K63），通过串联亲和纯化富集了高纯度、高可信的特异性泛素链修饰的底物蛋白，通过定量蛋白质组学技术大规模系统正向鉴定了特异性泛素链的底物；以期在此基础上系统研究K63泛素链的新生物学功能。